红曲黄色素对溶菌酶淀粉样纤维化抑制作用与机制研究.pdfVIP

摘要

蛋白质错误折叠与多种疾病相关。研究表明，天然产物中多种活性分子具有抑

制蛋白错误折叠与聚集行为的功效，因而对相关疾病具有改善作用。红曲色素是红

曲霉的次级代谢产物，其中红曲素（Monascin，MS）和安卡红曲黄素

(Ankaflavin,AK)已被证实，在改善阿兹海默症、缓解帕金森症等方面具有显著功

效，但是关于AK和MS在体外抑制淀粉样纤维的研究还尚未有报道。本研究利用鸡

蛋清溶菌酶（Heneggwhitelysozyme，HEWL）作为蛋白模型，以AK和MS作为研

究对象，揭示了AK和MS对HEWL淀粉样纤维的抑制作用机制和解聚作用，同时

利用分子对接技术和荧光光谱研究了AK和MS与HEWL之间的相互作用，为淀粉

样变性疾病的治疗提供新思路。主要结论如下：

（1）AK和MS对HEWL淀粉样纤维抑制作用研究

利用ThT荧光探针监测HEWL淀粉样纤维的生长情况，借助ANS荧光探针分

析HEWL淀粉样纤维化过程中疏水区域的暴露情况，结果表明，抑制剂和HEWL摩

尔浓度比为1:5时，AK对HEWL纤维化的抑制率为79.8%，MS的为49.63%。CD

光谱计算分析结果表明，HEWL淀粉样聚集过程中β-折叠结构含量从10.6%增多至

41.1%，α-螺旋结构从42.4%减少至21.5%，当抑制剂和HEWL摩尔浓度比为1:5

时，HEWL的α-螺旋结构含量分别提高至40.3%和31.3%。Tricine-SDS结果

表明，与未加入抑制剂相比，随着抑制剂AK和MS浓度的增加，HEWL纤维样品

在14.4kDa处条带变得明显，且同浓度下，AK比MS样品组在此分子量处的条带更

宽颜色更深。最后通过TEM观察HEWL纤维体形貌，结果发现加入AK和MS后

的HEWL纤维体数量减少，长度变短，宽度变窄。综上实验结果表明，AK和MS

对HEWL淀粉样纤维均具有抑制作用，且AK抑制效果比MS更明显。

（2）AK和MS对成熟HEWL淀粉样纤维解聚作用的研究

在成熟的HEWL淀粉样纤维中，利用ThT和ANS荧光检测技术探究了AK和

MS对HEWL淀粉样纤维的解聚能力，结果表明加入AK/MS:HEWL摩尔浓度比为

14:14时，ThT荧光强度值分别降低38%和25%，ANS荧光强度值分别下降44%和

16%。CD光谱结果显示，与未加入抑制剂的HEWL纤维相比，加入AK和MS后，

HEWL中β-折叠结构含量从44.8%减少至36.3%和27.9%，α-螺旋结构从20.9%增加

至25.3%和24.8%。综上实验结果证实AK和MS对HEWL纤维具有一定解聚能力，

且解聚能力具有浓度依赖性。

（3）AK和MS与HEWL相互作用的研究

本研究采用内源荧光和分子对接技术深入分析了AK和MS与HEWL之间的相

互作用，内源荧光试验结果表明，AK和MS对HEWL均为静态猝灭。计算AK-

HEWL体系和MS-HEWL体系中Ka值发现，AK较MS比与HEWL有更强的结合

力。三维荧光光谱结果发现AK和MS与HEWL结合后，荧光值下降且发生蓝移，

说明抑制剂与HEWL发生相互作用作用的同时改变了HEWL的空间构象和微环境。

分子对接实验验证了AK和MS与HEWL主要作用力为氢键、范德华力和疏水相互

作用。并且相互作用的氨基酸残基与利用FoldAmyloid软件预测的HEWL易聚集区

域相吻合，说明AK和MS通过与HEWL易聚集区域中的氨基酸残基相结合，阻碍

了HEWL分子的聚集，从而抑制HEWL淀粉样纤维的形成。

关键词：红曲色素；溶菌酶；淀粉样纤维化；抑制剂；相互作用

ABSTRACT

Misfoldingproteinsarerelatedwithseveraldiseases.Avarietyofnaturalcompounds

havebeenreportedtoinhibittheformationofamyloid