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质粒DNA的提取酶切及浓度检测.ppt

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**实验5质粒DNA的提取质粒的概念质粒:质粒是细菌染色体外的遗传物质,大小在1~200kb之间,大多是具有双股闭合环状结构的DNA分子,通常以超螺旋状态存在于细胞浆中。

PCR的模板01质粒作为克隆载体02(研究目的基因时,常需要提取质粒)03质粒提取目的AEDBCSDS裂解法煮沸裂解法试剂盒法氯化铯-溴化乙锭梯度离心法碱裂解法质粒提取的方法与原理碱裂解法溶液150mmol/L葡萄糖,10mmol/LEDTA,25mMTris-HClpH8.0。溶液22mol/LNaOH,1%SDS溶液3乙酸钾溶液(3M,pH=4.8):60mL的5mol/LKAc,5ml冰醋酸,5mLH2O培养细菌:将带有质粒的大肠杆菌接种到1.5-3ml含有相应抗生素的液体培养基,37℃培养12~16小时;取液体培养液1.5-3ml于Eppendorf管中,10000r/min离心1min,去掉上清液,加入100?l溶液1充分混匀放置3-5分钟;加入200?l新配制的0.2mol/LNaOH+1%SDS(变性液),加盖颠倒3-5次使之混匀,冰上放置5min;质粒小量提取的方法(手工提取):01020304加入150?l乙酸钾溶液(溶液III),加盖后颠倒3-5次混匀,冰上放置5min;沉淀用0.5ml70%乙醇清洗一次,12000r/min离心5min,弃去上清液,小管倒置于吸水纸上,除尽乙醇,室温自然干燥;用台式高速离心机,12000r/min离心15min,上清移入另一干净离心管,并加2倍100%乙醇混匀,12000r/min离心5min,弃去上清液;加入30-50?l含有20?g/mlRNase的灭菌蒸馏水或TE缓冲液溶解提取物,室温放置15-30min,使DNA充分溶解(有时需要酚:氯仿抽提);05将分离出的质粒DNA置于-20℃保存备用。注意:用移液器操作时,每一步都要格外小心,特别是在加入溶液II和III后,一定不要剧烈振荡,以免切碎DNA(包括质粒DNA和基因组DNA)!!!优点:操作简便、节约时间、性/价比高。原理:把硅胶薄膜的优点与经典的碱-SDS裂解细菌细胞法结合起来。质粒小抽试剂盒5ml的灭菌干净小离心管贰10,000xg以上高速离心机壹无水乙醇肆灭菌去离子水(或TE缓冲液)叁使用者需备使用前往准备好的SolutionI中加入RNaseA,稀释后的DNAWashBuffer需室温保存;浓缩的WashBuffer需用乙醇稀释:所有步骤必须在室温下操作。注意抽提质粒、分离纯化增殖细菌、扩增质粒结果鉴定裂解菌体、获取质粒实验操作步骤对于未经酶切的质粒来说,常会出现两条电泳带(松弛)螺旋状质粒DNA带超螺旋状质粒DNA的带以超螺旋状质粒DNA居多,移动速度也最快。有时还会出现三条带,其中一条是因为有一些质粒DNA在提取过程中遭到损伤而线性化,其移动速度介于螺旋状和超螺旋状质粒DNA之间。如果提取的质粒很好时,这条带会很弱,有时看不到。质粒DNA提取范例:质粒DNA的酶切鉴定实验目的和要求学习和掌握限制性内切酶的特性、酶解操作方法,并理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具。相关基础知识限制性核酸内切酶:是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。是体外剪切基因片段的重要工具,所以常常与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具,而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定。A限制性核酸内切酶的类型及特性B按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情况不同,分为三类:C型D型*E型能识别专一的核苷酸顺序,并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因此,这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸01II型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序,即有一个中心对称轴,从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。02II型限制性内切酶这种酶的切割可以有两种方式:粘性末端;是交错切割,结果形成两条单链末端,这种末端的核苷酸顺序是互补的,可形成氢键,所以称为粘性末端。如EcoRI的识别顺序为:5’……GAA|TT_C……3’3’……C_TT|AAG……5’垂直线表示中心对称轴,从两侧“读”核苷酸顺序都是GAATTC或CTTAAG

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