《RNA建库流程》课件.pptVIP

**********************RNA建库流程RNA建库是高通量测序的前提，将RNA样本转化为可供测序的DNA文库，便于进行深度测序分析。RNA提取1细胞裂解使用裂解液破坏细胞膜，释放RNA2RNA分离通过离心或其他方法分离RNA3纯化去除蛋白质和污染物，获得纯净的RNARNA提取是RNA建库的第一步，也是至关重要的步骤。该步骤需要使用特定的试剂和方法，以确保获得高质量的RNA样本。RNA定量与质量检测1RNA浓度使用分光光度计或荧光染料法测定。2RNA纯度A260/A280和A260/A230比值评估RNA纯度。3RNA完整性使用生物分析仪或电泳检测RNA完整性。RNA定量与质量检测是RNA建库流程中至关重要的步骤，确保后续实验的准确性和可靠性。RNA完整性验证RNA完整性评估RNA完整性非常重要，因为完整性会影响下游分析的准确性和可靠性。完整的RNA确保了所有mRNA片段都被检测到，从而提供全面的基因表达信息。电泳检测使用琼脂糖凝胶电泳可以直观地观察RNA的完整性。完整RNA应该显示出清晰的条带，表明RNA完整性良好。此外，电泳可以帮助识别降解的RNA，比如出现模糊或弥散的条带。RIN值评估使用专门的软件，比如AgilentBioanalyzer或RNAIntegrityNumber(RIN)软件，可以根据电泳图谱的特征计算RIN值。RIN值范围在1到10之间，值越高表示RNA完整性越好。其他方法除了电泳和RIN值外，还有一些其他方法可以评估RNA完整性，比如微芯片技术或其他基于荧光的检测方法。这些方法可以提供更全面的评估，帮助研究人员选择合适的RNA用于下游分析。RNA去DNA处理1目的去除样本中残留的基因组DNA，防止后续建库过程中DNA片段的干扰，确保最终测序结果的准确性。2方法DNaseI酶消化法RNaseH酶消化法磁珠法3关键点选择合适的去DNA方法，确保DNA完全去除，避免影响后续实验步骤。RNA逆转录逆转录酶逆转录酶是一种特殊的酶，它可以将RNA模板转化为互补的DNA链，称为cDNA。逆转录过程逆转录酶使用RNA作为模板，合成单链DNA，然后形成双链DNA。逆转录试剂盒市面上有各种逆转录试剂盒，可用于完成逆转录步骤。它们包含必要的酶、缓冲液和试剂。cDNA产量逆转录的效率决定了cDNA的产量，这将影响后续的建库和测序。cDNA纯化1磁珠法使用磁珠捕获cDNA，去除杂质和未结合的物质。磁珠法操作简便、快速，适用于多种类型的文库构建。2柱层析法利用不同分子大小或亲和力的差异，将cDNA从溶液中分离出来。柱层析法精确度高，适合对cDNA进行纯化和浓缩。3离心过滤法通过离心过滤去除杂质和未结合的物质。离心过滤法速度快，适合对cDNA进行快速纯化，但效率可能不如其他方法。cDNA定量cDNA定量是RNA建库流程中的重要步骤，它能够准确测定cDNA的浓度，为后续实验提供可靠的依据。1选择定量方法根据实验需求选择合适的定量方法，例如荧光定量PCR或纳米滴定仪等。2样品准备将cDNA样品稀释至适当浓度，并进行严格的质量控制。3定量分析使用选定的定量方法对cDNA样品进行测定，获得准确的浓度信息。4数据记录详细记录定量结果，包括样品名称、浓度、时间等信息。cDNA定量的准确性对后续的建库和测序至关重要，因此需要严格按照操作步骤进行。cDNA片段化1随机打断使用超声波或酶切方法2大小控制获得特定长度片段3质量控制确保片段完整性和均匀性cDNA片段化是RNA测序文库构建的关键步骤之一。它将长链cDNA打断成特定长度的片段，方便后续接头连接和测序。末端修复5端磷酸化利用T4多聚核苷酸激酶(T4PNK)将5端磷酸化，使5端具有活性，便于后续接头的连接。3端加A利用末端转移酶(TdT)在3端添加一个腺嘌呤碱基(A)，以便与接头进行互补配对。平滑末端对具有黏性末端的DNA片段进行平滑处理，使其成为平滑末端，以便与接头进行连接。接头连接1连接酶连接接头与cDNA片段2温度严格控制反应温度3时间确保接头连接效率4浓度优化连接酶浓度接头连接是RNA建库的关键步骤，需要使用连接酶将接头连接到cDNA片段的末端。接头含有测序引物结合位点，用于后续的测序反应。连接反应的效率会影响文库的质量，因此需要严格控制反应条件，例如温度、时间和连接酶的浓度。大小选择1目的选择特定大小的DNA片段进行下一步反应，避免测序结果过于冗长或出现偏差。2方法根据目标测序范围