酶与细胞固定化.ppt

无载体法基本概念：在没有载体的情况下，借助物理或化学方法，将细胞直接固定化的方法。这种固定化，既可发生在细胞结构上，也可通过细胞聚集来完成。包括去自溶酶法和絮凝法。去自溶酶法：细胞所具有的酶系，从广义上讲已是一种固相酶，因此用简单的加热、冻冻，β-射线幅射等物理手段处理细胞，使细胞的自溶酶系失活，防止目的酶被水解，由此得到的细胞实体，为固相细胞。向待固定的细胞液中加入絮凝剂，使细胞凝聚在一起，过滤，收集絮凝细胞，装柱，即为可使用的固相细胞。常用絮凝剂：活性硅胶、聚赖AA、聚丙烯酰胺等。絮凝法：霉菌（赫曲霉、酱油曲霉、米曲霉）01放线菌（灰色链霉菌、酒红链霉菌、石灰壤诺氏卡菌、椿象虫诺卡氏菌）02细菌（嗜虫短杆菌、产碱细菌、铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、红平红球菌、金黄色葡萄球菌及运动发酵单胞菌）03酵母菌（啤酒酵母及葡萄汁酵母、粟酒裂殖酵母、异常汉逊酵母等）04目前已报道的有絮凝性的微生物有：酶催化反应产物为酸性：最适pH向碱性偏移。酶催化反应产物为碱性：最适pH向酸性偏移。酶催化反应产物为中性：最适pH不改变。(2)产物性质对最适pH影响；01带负电荷载体：最适pH向碱性偏移。带正电荷载体：最适pH向酸性偏移。不带电荷载体:最适pH一般不改变。酶经固定化后，其作用的最适pH常会发生偏移，影响固定化酶最适pH的因素：(1)载体性质对最适pH影响：023.最适反应pH：影响原因：固相酶颗粒在水溶液中，是被一层几乎不流动的液体包围着，这层不流动液体叫做扩散层。载体的带电性质之所以会影响固定化酶的最适pH值，是由于在使用带负电荷的载体时，载体会吸引反应液中的氢离子(H+)到其附近，致使固定化酶所处反应区域的pH值比周围反应液的pH值低一些，这样就必须把反应液的pH值提高一些，才能使酶充分发挥其催化功能。故此，固定化酶的最适pH显得比游离酶的最适pH值高一些。反之，带正电荷的载体对氢氧根负离子有吸引作用，由它制备的固定化酶的最适pH值要比游离酶的最适pH值低一些。影响原因：固定化载体成为扩散阻碍，使反应产物向外扩散受到一定的限制所造成的。当反应产物为酸性时，由于扩散受到限制而积累在固定化酶所处的催化区域内，使此区域内的pH值降低，必需提高周围反应液的pH值，才能达到酶所要求的pH值。为此，固定化酶的最适pH值比游离酶要高一些。反之，反应产物为碱性时，由于它的积累使固定化酶催化区域的pH值升高，故此使固定化酶的最适pH值比游离酶的最适pH值要低一些。4.最适反应温度：最适温度与酶稳定性有关。多数酶固定化后热稳定性上升，最适温度也上升（有例外）。01同种酶，采用不同的方法或不同载体固定化后，其最适温度可能不同。025.动力学常数：Km与Vm固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能变化。固定化载体与底物电荷相反,固定化酶的表观Km值降低。固定化载体与底物电荷相同,固定化酶的表观Km值显著增加。Vm固定化前后相同或接近（也有例外）。底物特异性固定化酶底物特异性与游离酶相比，有一定变化，一般为：作用于小分子底物的酶类经固定化后，专一性基本不变。而既可作用大分子也可作用小分子底物的酶类经固定化后专一性会发生变化。影响原因：固定化酶底物特异性的改变，是由于载体的空间位阻作用引起的。酶固定在载体上以后，使大分子底物难于接近酶分子而使催化速度大大降低，而分子量较小的底物受空间位阻作用的影响较小或不受影响，故与游离酶的作用没有显著不同。四、固定化酶的应用1.在食品工业中的应用2.在医药领域的应用3.生物传感器4.环境保护乳制品中乳糖不耐症：有些人体内缺乏乳糖，在饮用牛奶后会发生腹泻、腹胀（酸奶不会）。这是因为不能消化牛奶中的乳糖，β-半乳糖苷酶：又称乳糖酶，可用于水解乳中存在的乳糖，用于制造低乳糖奶。采用固定化乳糖酶可连接生产低乳糖奶，已于1977年实现工业化。糖化需要α-淀粉酶，而麦芽中的α-淀粉酶不足，需添加外源性的淀粉酶来补充，因此可将发酵液连续通过固定化淀粉酶反应器。例如，在制造啤酒时，可以试用固定化微生物淀粉酶替代麦芽水解淀粉酶。1另外，采用固定化蛋白质分解酶类来水解蛋白质或多肽也正在研究之中。啤酒经长时间存放后，含有的多酚类和多肽结合在一起，产生所谓冷浊。现在主要是应用木瓜酶来防止这种现象的发生，但长期往啤酒中添加这类蛋白质分解酶，会对蛋白质分解产生不良影响。为克服这一缺点，目前，正在利用固定化木瓜酶和固定化多酚氧化酶研究解决啤酒的防