细胞的破碎与分离.ppt

影响匀浆破碎的主要因素：压力、温度、通过匀浆器阀的次数易造成堵塞的团状或丝状真菌较小的革兰氏阳性菌含有包含体的基因工程菌不宜采用高压匀浆法的细胞类型。大、中、小型高压匀浆器超声波破碎法（Ultrasonication)利用超声波振荡器发射的15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的声频、声能有关。超声破碎法（Ultrasonication）010203一般认为在超声波作用下液体发生空化作用（cavitation),液体中局部空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，引起的粘滞性旋涡在细胞上造成了剪切力，使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。操作过程产生大量的热，因此操作需在冰水或外部冷却的容器中进行。超声波破碎的机理”超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物的破碎。一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。超声波破碎的有效能量利用率极低由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，但在实验室小规模细胞破碎中常用。0304050102超声波破碎的适用范围机械法的缺点需要高的能量并且产生高温和高的剪切力，容易使不稳定产品变性失活；就破碎的有机体或释放的产物而论，它们是非专一的，并且产生碎片微粒尺寸的大范围细分布，大量细颗粒给分离带来了困难。010201酶溶破碎法（enzymelysis）02化学破碎法（chemicaltreatment）03渗透压冲击破碎法（osmoticshock）04冻融破碎法（freezingandthawing）二非机械破碎方法非机械法又可分为：1.酶溶法（EnzymaticLysis）酶解是利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜。04溶菌酶β-1，3-葡聚糖酶β-1，6-葡聚糖酶蛋白酶甘露糖酶糖苷酶肽键内切酶壳多糖酶等03外加酶法01常用的溶酶02酶解法的特点是专一性强，因此在选择酶系统时，必须根据细胞的结构和化学组成来选择。放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖为主要成分，所以也能采用溶菌酶，植物细胞壁的主要成分是纤维素，常采用纤维素酶和半纤维素酶裂解。溶菌酶（lysozyme)能专一性地分解细胞壁上肽聚糖分子的β-1,4糖苷键，因此主要用于细菌类细胞壁的裂解。革兰氏阳性菌悬浮液中加入溶菌酶，很快就产生溶壁现象。但对于革兰氏阴性菌，单独采用溶菌酶无效果，必须与螯合剂EDTA一起使用。酵母和真菌由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、几丁质等，常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等。12345（1）外加酶法有时采用几种酶的混合物会产生更好的效果，加入时需确定相应的次序。01对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质-甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破裂，释出胞内产物。02（1）外加酶法产品释放的选择性高；抽提的速率和收率高；产品的破坏最少；条件温和，对PH值和温度等外界条件要求低；不残留细胞碎片。优点：溶酶价格高，溶酶法通用性差，产物抑制的存在。缺点：酶溶法的优缺点自溶法（Autolysis）自溶作用是酶解的另一种方法，利用生物体自身产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶。在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续下去。自溶作用：改变其生长环境（温度、ｐＨ、缓冲液），可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其它的自溶酶，以达到自溶目的。缺点是：易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。化学渗透法（Chemicalpermeation）该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。碱能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从细胞内渗漏出来。酸处理可以使蛋白质水解成氨基酸，通常采用6mol/LHCl。采用酸碱调节溶液的PH值，改变细胞所处的环境，从而改变两性产物——蛋白质的电荷性质，使蛋白质之间或蛋白质与其他物质之间的作用力降低而易于溶解到液相中去，便于后面的提取。成本低，反应激烈，不具选择性。（1）酸、碱处理法十二烷基硫酸钠（SDS，阴离子型）；非离子型如TritonX-1