有声（2） PCR反应条件的确定.pdf

实验二、目的基因片断的体外扩增

讲解（2）

讲解内容(2)

一、PCR的概念

二、PCR的基本原理

三、PCR的基本流程

四、PCR反应体系的各成分及其对PCR的影响

五、PCR反应条件的确定

六、常见问题与对策

五、PCR反应条件的确定

主要包括：

•变性温度：一般选用94～95℃。

•变性

•变性时间：一般选用30～45秒。

•退火

•延伸

30个循环时，变性共需要15~22.5min。

•循环次数

•HalflifeofTaqDNApolymerase

92.5℃2hours，

95℃40mins，

97℃5mins.

五、PCR反应条件的确定

主要包括：

•变性

•退火是影响PCR特异性的重要因素！

•退火

•延伸

•循环次数

退火温度对PCR反应的影响：

(1)Correctannealingtemperature(2)Annealingtemperatureistoolow

Primingoccuresonlyatthe

Mismatchedhybrid.

desiredtargetsites.

(2)Annealingtemperatureistoohigh(1)(2)(3)

Primersandtemplatestendstobedissociated.

退火温度偏高，产物量减少，但反应特异性(specificity)高。

五、PCR反应条件的确定

主要包括：•通过参考引物的Tm值，选择退火温度

•Tm(meltingtemperature,解链温度):当50

•变性％的引物与互补序列表现为双链DNA分子时的温度。

•退火•长度20mer的引物，

•延伸Tm计算公式为：＝4℃(G+C)+2℃(A+T)

•退火温度=Tm－（2～10℃）

•循环数

•退火温度：50℃~65℃。对于20个核苷酸，G+C含量约

50%的引物，55℃作为退火温度的起点较为理想。

•较高的退火温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，

提高PCR反应的特异性。

•但退火温度不能太高，要保证引物同目的序列有效退火。

五、PCR反应条件的确定

主要包括：

•温度：Taq酶的最适工作温度：72℃或74℃

•变性

•退火•时间：取决于待扩增基因片段的长短

•延伸

•循环次数•酶的延伸效率：约1kb/min。

•1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够）

3～4kb的靶序列需3～4min