血清丙氨酸氨基转移酶.ppt

测定前将底物液在37°C水浴中预温5min酶活力测定Page?*青衣青衣血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）活力的测定方法:改良赖氏法组员：魏青宇何彩云肖磊柯艾青了解血清ALT活力单位的定义。01掌握血清ALT活性测定的方法及临床意义。02【目的要求】原理：正常情况下，血清中各种酶含量稳定，病理情况下则反之。如：许多组织器官的疾病表现为血清酶活力的异常。通过血清酶活力的测定可以作为器官，组织疾病及恶性肿瘤的临床诊断。造成血清酶活力异常的原因有：（1）细胞酶及细胞标志酶的释放入血液（2）酶的合成增强（3）酶清除受阻（4）器官功能损伤详见p54血清酶活力测定的临床意义实例说明：ALT测定的临床意义ALT广泛存在于机体的各种组织中，但在肝细胞中含量最多。当肝脏有病变时特别是急性肝炎及肝细胞坏死时，血清中ALT活力显著升高。在肝癌，肝硬变及胆道疾病时，此酶活力也可中度或轻度增高。另外，其他脏器或组织疾病，该酶活力也升高。how?知识回顾:血清中碱性磷酸酶（ALP)活力的测定（磷酸苯二钠法）ALP磷酸苯二钠+H2O苯酚+磷酸氢二钠pH=10酶促反应苯酚+4-氨基安替比林铁氰化钾红色醌亚胺衍生物显色反应碱性磷酸酶活力的测定的方法（标准对照法）1ml血清（反应总量为3ml）在25℃，340nm，内径为1cm的比色皿，1分钟，A下降0.001的酶量丙氨酸+α-酮戊二酸谷氨酸+丙酮酸卡门氏法酶活力单位：赖氏法：ALT丙酮酸+2,4二硝基苯肼OH-丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，改良赖氏法010203040506(2)本次实验的方法：改良赖氏法”本实验卡门氏法测ALT活力的方法为什么被赖氏法取代？他们各自的测定原理，说明两种方法的区别与联系？答：由于NADH在波长340nm处有特异吸收峰，因此ALT的活性可通过NADH（反应物）的减少量，亦即通过340nm吸光度的减少量间接作出定量测定。这一方法特异性、准确性高。但是此法除要加入待测酶ALT的底物外，还需要加入指示酶LDH及其辅酶NADH，又需用紫外分光光度计，因此不易为一般临床化验室推广。答：丙氨酸+α-酮戊二酸ALT谷氨酸+丙酮酸丙酮酸+NADH乳酸脱氢酶乳酸+NAD+卡氏测定ALT活力的原理小结：区别与联系实验原理：是一种α-氨基酸的α-氨基转移到一种α-酮酸上的过程。转氨基作用是氨基酸脱氨基作用的一种途径。其实可以看成是氨基酸的氨基与α-酮酸的酮基进行了交换。作用：结果是生成了一种非必需氨基酸和一种新的α-酮酸。转氨基作用知识链接：碱性条件下，产物由黄色变为红棕色2,4二硝基苯肼的性质1红色结晶性粉末分子量198.14微溶于水、乙醇，溶于酸对眼和皮肤有刺激性。对皮肤有致敏性。本品吸收进入体内，可引起高铁血红蛋白血症，出现紫绀遇明火极易燃烧爆炸。干燥时经震动、撞击会引起爆炸。燃烧时放出有毒的刺激性烟雾。与氧化剂混合能形成爆炸性混合物。【有害燃烧产物】一氧化碳、二氧化碳、氮氧化物2知识链接：α-酮戊二酸也能与2,4二硝基苯肼结合成相应的苯腙，在碱性条件下显色。对实验结果有何影响？答：α-酮戊二酸因其量不多，加之对520nm的吸光度远不如丙酮酸生成的苯腙硝醌化合物强，尤其用标准曲线作测定时，所用的酶活性单位通过卡门氏分光光度速率法矫正，摈弃了赖氏法一些固有弊端，α-酮戊二酸对于结果影响不大，测定结果也比其他比色法（金氏法（King法）、穆氏法（Mohun法）和赖氏法（Reitman-Frankel法））准确。ALT底物液【2mmol/Lα-酮戊二酸,20mmol/L丙氨酸】（2）pH=7.4的PBS丙酮酸标准液[2mmol/L]（4）2,4二硝基苯肼溶液【1mmol/L](5)0.4mmol/LNaOH实验试剂：logoALT活力的测定标准曲线的制作01混匀，室温10min,蒸馏水调零，520nm比色，绘制标准曲线03卡门氏单位0428579