基于不稳定质粒的链霉菌无痕敲除方法的建立与应用.pdfVIP

摘要

棒状链霉菌（StreptomycesclavuligerusATCC27064）是一种可用于工业发酵生产

克拉维酸的放线菌。该菌除了可以生产克拉维酸外，还能产生头孢霉素、氧青霉烷和

全霉素等。棒状链霉菌还具有植物黄酮类天然产物柚皮素的天然合成能力，在柚皮素

的微生物发酵生产方面具有很大的潜力。但是，目前棒状链霉菌中的柚皮素合成途径

还不清晰，这一现状阻碍了高产柚皮素的工程菌的构建进程。由于棒状链霉菌转化效

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率低、生长温度狭窄（℃），传统的基因敲除方法和在模式菌中建立的

CRISPR/Cas9基因编辑方法（一般基于自杀型质粒或温度敏感型质粒），在棒状链霉

菌中都不能使用。棒状链霉菌中使用的基因敲除方法，目前多依赖于链霉菌高拷贝游

离质粒，敲除株筛选工作量大而且筛选周期长。因此，本课题开发了一种基于不稳定

质粒的基因无痕敲除方法，并采用该方法开展了棒状链霉菌中柚皮素合成相关基因的

遗传学解析。具体研究内容和结果如下：

（1）基于不稳定质粒的基因无痕敲除方法的建立。首先，以链霉菌高拷贝质粒

pIJ101为出发质粒，对该复制区逐渐截短并在模式链霉菌中评估稳定性，筛选获得了

链霉菌不稳定复制质粒pLH1843、pLH1842和pLH1841。在选择性条件下，这三个质

粒可以在链霉菌中稳定复制；在无选择性压力的情况下，一个产孢周期中，pLH1841、

pLH1842pLH184399.93%99.98%99.94%

和的丢失率达分别为、和。但是，含有

pLH1841pLH1843

和游离质粒的模式菌株培养时，产孢能力很差，故不适合作为菌

株改造的工具质粒。因此，本课题选择了pLH1842质粒作为不稳定系统敲除体系的出

发质粒。把强启动子PermE驱动的，来自D314A编码基因优化后得到codA的基因序

列和目的基因的同源臂克隆入质粒pLH1842后得到工具载体pLH1847，成功的在天

蓝色链霉菌中实现了SCO6273基因的敲除，得到了突变菌株S3227。基因敲除的具体

流程包括：重组质粒的构建和转化，单交换重组子的筛选和双交换重组子的筛选。质

粒pLH1847不稳定质粒的特性方便了单交换重组子的筛选过程，codA基因作为反向

筛选标记方便了基因敲除双交换重组子的筛选过程。

（2）棒状链霉菌中柚皮素合成途径的遗传学解析。柚皮素是一种植物黄酮类化

合物。通过与植物中柚皮素合成途径对比，棒状链霉菌中发现了3个柚皮素植物合成

途径中的同源基因：酪氨酸解氨酶基因（tal）、4-香豆酸辅酶A连接酶基因（4Cl）

NCS

和查尔酮合成酶基因（）。但是，柚皮素植物合成途径中最后一个酶查尔酮异构

CHI

酶（），相关同源基因并没有在棒状链霉菌基因组上发现。发现的三个同源基因

分布在棒状链霉菌基因组的不同位置，与NCS处在同一个转录单元还存在一个编码细

PncyPncyP

胞色素加氧酶基因（）。本研究采用新建立的敲除方法，对棒状链霉菌中

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基因进行敲除，获得了ncyP敲除突变株S3228。菌株发酵和柚皮素HPLC分析显示

突变株S3228柚皮素产量是野生型菌株的15%。

本研究建立的基于不稳定质粒的链霉菌敲除系统，对众多工业链霉菌的遗传改造

具有独特的优势。利用该敲除系统，完成了棒状链霉菌中基因敲除，获得了细胞色素

P加氧酶基因（ncyP）的敲除突变株，进一步的检测表明该基因与柚皮素的合成密

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切相关。该发现为棒状链霉菌中柚皮素合成途径的最终阐明和高产工程菌株的构建都

具有重要意义。

关键词：不稳定质粒；链霉菌基因敲除；棒状链霉菌；柚皮素生物合成

ABSTRACT

Streptomycesclavulans(S.clavuligerusATCC27064)isakindofa