- 1、本文档共10页,可阅读全部内容。
- 2、有哪些信誉好的足球投注网站(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
- 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载。
- 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
细胞冷冻原理在不加保护条件下直接冻存细胞时,细胞内和外环境中的水会形成结晶,能导致细胞内发生一系列变化,如电解质浓度升高、渗透压改变、脱水、等,能引起细胞死亡。向培养基中加入保护剂甘油或二甲基亚砜(DMSO),可使冰点降低,在缓慢的冻结条件下,能使细胞内水分在冻结前透出细胞外。贮存在-130℃以下低温中能减少冰晶的形成。溶解细胞时,速度要快,使之迅速通过细胞最易受损的-5℃~0℃。冷冻方法选用对数生长期细胞,在收集细胞24h前换液一次。用常规胰蛋白酶消化将细胞消化下来,按106-107/ml细胞浓度,悬浮于含10%DMSO的培养液中(此时培养液要冷的,因DMSO仔常温下可以产生毒性)用吸管吸取细胞悬液,分装于0.25ml的细胞冻存管中用火烧封口。冻存4℃半个小时------20℃2小时----80℃过夜-----液氮长期保存。解冻方法1将冻存于液氮中的冻存管取出,迅速放入37℃水浴中使其在1min内融化。2用75%酒精喷细胞冷冻细管用灭菌过的纱布擦试细管---------用灭菌过剪刀剪掉细管2头------将细胞悬液移至离心管中,补加培养液,1500rpm低速离心6min,去上清(DMSO在常温下对细胞有毒,应在细胞复苏后尽量除去)-------弃掉上清液、加培养液进行培养------第二天待细胞贴壁时进行换液把死的细胞去除-------后每隔2-3天换液----待细胞生长至一定密度后即可传代。(解冻方法速度一定要快)3细胞活力
将细胞悬液以0.5ml加入试管中。
加入0.5ml0.4%台盼兰染液,染色2一3分钟。吸取少许悬液涂于载玻片上,加上盖片。
镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数,计细胞活力。
死细胞能被台盼兰染上色,镜下可见深兰色的细胞,活细胞不被染色,镜下呈无色透明状染色体检查将一瓶处于对数生长期的细胞放入4℃冰箱12小时,然后弃去旧液,分别加入含秋水仙素终浓度为0.4~0.6μg/ml的DMEM培养液继续培养4~6小时,收集细胞。加入1ml新配制的固定液(甲醇:冰醋酸=3:1)预固定3分钟,离心收集细胞。弃离心上清,加入0.7ml固定液,反复吹打混匀。弃离心上清,加入预热的0.5毫升KCl(0.075m/ml)混匀,后补加到5ml,37℃孵育35分钟(此步骤为低渗,让细胞膜破裂)。弃离心上清,再缓缓加入5ml固定液4℃冰箱中固定50分钟,低速离心收集细胞。取-20℃冰冻的载玻片,吸取悬液于25cm高度(保持一定的高度利于染色体分散开利于计数)滴于载玻片上,在酒精灯上迅速烘干,用Giemasa(原液:PBS=1:9)染色30分钟,冲洗,干燥。显微镜下观察123456水牛胎儿成纤维细胞染色体免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理,先将已知的抗体标记上荧光素,再以这种荧光抗体作为探针检查细胞或组织内的抗原.在细胞或组织形成的抗原抗体复合物上含有荧光素,利用荧光显微镜观察标本,荧光素受发光的照射而发出明显的荧光,可以看见荧光所在细胞或组织,从而确定抗原的性质、定位以及利用定量技术测定定量。荧光抗体壹FITC(异硫氰酸荧光素)标记,最大吸收光谱为490-495nm最大发射光谱为520-530,呈黄绿色荧光。贰四乙基异硫氰酸罗达明(TMRITC)标记最大吸收光谱为550nm,最大发射光谱为620nm,橙红色荧光,与FITC的黄绿色光对比清晰,与蛋白质结合方式同FITC,可以用来双标记研究。细胞免疫荧光染色基本步骤把灭菌的盖玻片放入培养皿中然后细胞接种培养。01吸出培养液加入4%多聚甲醛室温固定15min(为了更好的保持细胞和组织原有的形态结构,防止组织自溶,有必要对细胞和组织进行固定。固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固,终止或抑制外源性和内源性酶活性,更重要的是最大限度的保存细胞和组织的抗原性,使水溶性抗原转变为非水溶性抗原,防止抗原弥散。)02吸出旧液0.01%Ttitonx-100的TBSA洗3次,加1%Ttitonx-100的PBS室温作用5min(目的是提高细胞的通透性利于抗体进入)A吸出去污剂,用0.01%Ttitonx-100的TBSA将盖玻片洗三次,各5min,弃液体但不要干燥.B1%BSA封1h。C加入一定比例一抗避光孵育60min(如需孵育更长时间可以考虑在培养箱里保持湿润避免干燥,如有必要则在4度冰箱中孵育过夜)0.01%Ttitonx-100TBSA洗几次,后加FITC标记的二抗室温标记60min。细胞培养基础知识覃兆鲜细胞培养概念:细胞培养是指用机械法或酶消化法从组织中分离出细胞,并摹拟体内环境,在无菌、适当温度、酸碱度和营养条件下,使其生长增殖,并维持其正常结构和功能的一
文档评论(0)