cko小鼠seqsp9 kf载体构建详细报告.pdfVIP

SP9-KF载体构建报告

一．构建方案：

二．构建概要：

1．SP9-KF的BAC-EL250的鉴定，同时也对的BAC做个鉴定。

2．BACLOXP元件（BAC-LOXP）。

3．BAC-LOXP中ZEO元件（BAC-LOXP-ZEO）。

4．PL253套取载体套取BAC-LOXP-ZEO（PL253-SP9-LOXP-ZEO）。

5．PL253-SP9-LOXP-ZEO转化araEL350，去除neo（PL253-SP9-ZEO-LOXPpopout）。

6．PL253-SP9-ZEO-LOXPpopout做Gateway反应，得到终载体（SP9-Gateway）。

7．终载体SP9-Gatewaypopout验证并。

三．具体构建过程

1．BAC转化EL250后的PCR验证

订购了2个BAC:BMQ-366A07和BMQ-377K12，设计如图

两个BAC同时转化EL250,鉴定如下：

BMQ-366A07（1-6号）和BMQ-377K12（a-d号），下同。

SP9-KF-H1F:

ATAAGAATGCGGCCGCGCGATCGCGGTTTCCTAGTGATGCAGTAAAC

SP9-KF-H1R:

AATAATTGCCCAAATAGGGAGAAGttaattaaACCAGCCCTGAGTTCAAATAGAT

PCRLength：498bp

DL2000:20000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp

SP9-KF-H2F:CTTCTCCCTATTTGGGCAATTATT

SP9-KF-H2R:GGACTAGTCGCAATGGGCCTGTTCTGACTTAC

PCRLength：507bp

KT246和KT247引物用来鉴定菌种EL250。

图中的BAC既是订购的BAC划单克隆挑菌提质粒用来作对照。

2．元件LOXP和ZEO

1）取验证正确的A07BAC-EL250