酵母双杂交技术及其在蛋白质组.ppt

原理：正常情况下，当有生长信号刺激的时候，酵母的Ras鸟苷酸交换因子Cdc25会富集到细胞膜上；这时Cdc25能够促使Ras蛋白的GDP与GTP的交换，启动下游的信号，促进酵母细胞的生长。在酵母温度敏感缺陷株CDC25-2中，Cdc25由于突变丧失了上述功能，使得此菌株只能在25摄氏度下生长，而在限制温度37摄氏度无法生长。Sos是哺乳动物细胞中的Ras鸟苷酸交换因子，与酵母的Ras鸟苷酸交换因子Cdc25同源；研究发现人Sos能够替代酵母Cdc25，使酵母细胞存活和增殖。于是在酵母温度敏感缺陷株Cdc25-2中，当人的Sos与膜定位信号（肉豆蔻酰化或法呢酯化信号）融合后，就会富集到细胞膜上，从而以不依赖配体的方式活化Ras及生长信号，弥补Cdc25的突变，使该菌株在37摄氏度可以生长。双杂交系统的另一个构成部分是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(repeetergene)的重组质粒的细胞。目前，大多采用的是酵母细胞。其具有以下优点:检测在真核活细胞内进行,在一定程度上代表细胞内的真实情况。作用信号是在融合基因表达后,在细胞内重建转录因子的作用而给出的,省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。检测的结果可以是基因表达产物的积累效应,因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库,能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。同时,酵母表型,X—Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。酵母双杂交技术及其在蛋白质组研究中的应用１.蛋白质组的概述２.酵母双杂交系统３.酵母双杂交在蛋白质组学中的应用（1）.产生背景基因组研究自从开展以来已经取得了举世瞩目的成就。在过去几年中,已经陆续完成了包括大肠杆菌、酿酒酵母等十多种结构比较简单的生物的基因组DNA的全序列分析。规模更为庞大的人类基因组计划在2005年完成全部基因组DNA的序列分析。但是也随之产生了新问题。大量涌出的新基因数据迫使我们不得不考虑这些基因编码的蛋白质有什么功能这个问题。不仅如此,在细胞合成蛋白质之后,这些蛋白质往往还要经历翻译后的加工修饰。也就是说,一个基因对应的不是一种蛋白质而可能是几种甚至是数十种。包容了数千甚至数万种蛋白质的细胞是如何运转的？或者说这些蛋白质在细胞内是怎样工作、如何相互作用、相互协调的？这些问题远不是基因组研究所能回答得了的。正是在此背景下,蛋白质组学(proteomics)应运而生。蛋白质组(proteome)一词是马克.威尔金斯(MarcWilkins)最先提出来的,最早见诸于1995年7月“Electrophoresis”杂志上,它是指一个有机体的全部蛋白质组成及其活动方式。当前蛋白质组学的主要内容是,在建立和发展蛋白质组研究的技术方法的同时,进行蛋白质组分析。对蛋白质组的分析工作大致有两个方面：一方面,通过二维凝胶电泳得到正常生理条件下的机体、组织或细胞的全部蛋白质的图谱,相关数据将作为待检测机体、组织或细胞的二维参考图谱和数据库。一系列这样的二维参考图谱和数据库已经建立并且可通过联网检索。二维参考图谱建立的意义在于为进一步的分析工作提供基础。蛋白质组分析的另一方面,是比较分析在变化了的生理条件下蛋白质所发生的变化。如蛋白质表达量的变化,翻译后修饰的变化,或者可能的条件下分析蛋白质在亚细胞水平上的定位的改变等。0102（2）蛋白组简介(3)蛋白质组学过程2.酵母双杂交系统2.1双杂交系统的原理2.2Sos恢复系统2.3优点及局限酵母双杂交技术是1989年由Fields等最先应的。与其他技术相比，它省去了耗时耗力的蛋白表达纯化以及抗体制备步骤，并且可以用于高通量的筛选，因此以其简便、快捷与廉价的优点迅速发展成为一种常用的研究蛋白质相互作用的方法。根据对文献的统计，目前已知的蛋白质相互作用至少有一半是通过酵母双杂交实验发现的。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白———蛋白的相互作用。主要结构由含有DNA结合域和DNA转录激活域二类载体以及酵母报告株构成。01将DNA—BD与已知的诱饵蛋白质X融合,构建出BD-X质粒载体;将AD基因与cDNA文库,基因片段或基因突变体(以Y表示)融合,构建出AD-Y质粒载体。02Fields等人的工作标志双杂交系统的正式建立。他们以与调控SUC2基因有关的2个蛋白质Snf1和Snf2为模型,将前者与GaL4的DB结构域融合,另外一个与