基于布鲁氏菌密度感应系统转录激活因子VjbR和BlxR新型亚单位疫苗株的构建及免疫效果的评价 (1).pdf

摘要

布鲁氏菌病，简称布病，是一种常见的人畜共患病，由革兰氏阴性、兼性胞内寄生

的布鲁氏菌引起。这种病可导致严重的经济损失和人类疾病。由于人体对动物源性布鲁

氏菌病易感，因此，动物源性布鲁氏菌病的控制可以根除人类布鲁氏菌病。近几十年以

来，我国已经有多种布鲁氏菌疫苗上市。例如，减毒活疫苗Rev.1、S19、S82、RB51

和M5-90，虽然这些疫苗为动物提供了较好的抵抗布鲁氏菌的免疫力，但依然存在缺点。

因此，开发一种新型安全有效的布鲁氏菌疫苗成为了研究的重点任务。

本研究以布鲁氏菌密度感应系统转录激活因子VjbR和BlxR为研究对象。为了获得

布鲁氏菌密度感应系统转录激活因子VjbR和BlxR重组蛋白（rVJBR和rBLXR），并

分析其诱导机体产生的免疫反应性，从NCBI网站上获取vjbR（BMEII1116）和blxR

（BMEII1758）全基因组序列，设计相应的引物，通过PCR扩增获得vjbR和blxR基因

全序列，连接至pET-32a原核表达载体，并构建原核表达载体pET-32a-VjbR和

pET-32a-BlxR，转化至大肠杆菌感受态细胞（DE3）中，经公司测序鉴定后，用异丙基

硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达rVJBR和rBLXR蛋白，SDS鉴定两个蛋白的可

溶性形式。利用亲和层析镍柱纯化rVJBR和rBLXR蛋白。rVJBR和rBLXR蛋白配合

弗氏佐剂制备成rVJBR、rBLXR和rVJBR-rBLXR油包水亚单位疫苗。同时，构建

pcDNA3.1-VjbR和pcDNA3.1-BlxR重组质粒，制备成pcDNA3.1-VjbR、pcDNA3.1-BlxR

和pcDNA3.1-VjbR-BlxRDNA疫苗。分别将rVJBR（50μg/只）、rBLXR（50μg/只）

和rVJBR-rBLXR（100μg/只）重组蛋白亚单位疫苗，pcDNA3.1-VjbR（50μg/只）、

pcDNA3.1-BlxR（50μg/只）和pcDNA3.1-VjbR-BlxR（100μg/只）DNA疫苗以及A19

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活疫苗（1×10CFU/只）利用皮下注射的免疫方式对BALB/c小鼠进行免疫，每隔7d

免疫一次，共免疫7次。三免后每7d对小鼠进行一次尾部静脉采血。用ELISA技术检

测小鼠血清中的细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-1β、TNF-α和IgG抗体的水平，

对小鼠进行攻毒，检测重组蛋白亚单位疫苗和DNA疫苗对小鼠的免疫保护效果。Western

Blot检测小鼠血清与重组蛋白rVJBR、rBLXR和rVJBR-rBLXR以及重组质粒

pcDNA3.1-VjbR、pcDNA3.1-BlxR和pcDNA3.1-VjbR-BlxR的反应原性。

PCR扩增结果显示，成功获得大小为780bp和717bp的vjbR和blxR基因片段，

与NCBI网站上vjbR和blxR基因全序列大小一致，分别编码259和238个氨基酸。公

司测序结果与原序列的同源性为100%。SDS鉴定结果表明，VjbR和BlxR蛋白

主要以可溶性形式表达，分子量的大小分别为28.86kDa和26.53kDa。ELISA检测结果

发现，与生理盐水对照组相比，rVJBR、rBLXR、rVJBR-rBLXR、pcDNA3.1-VjbR、

pcDNA3.1-BlxR、pcDNA3.1-VjbR-BlxR均可诱导小鼠产生IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-1β、

TNF-α和IgG抗体，并且随着免疫时间的不断延长分泌细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、

IL-1β、TNF-α和IgG抗体的量逐渐升高，除rVJBR和rBLXR分别诱导产生的TNF-α

和IgG抗体的量在第42d达到峰值，其他各组均在第35d分泌细胞因子IFN-γ、IL-2、

IL-4、IL-5、IL-1β、TNF-α和抗体IgG的量达到最大值。联