牛乳中A2型β-酪蛋白（A2奶）检测技术规程.docxVIP

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DB××/T××××—××××牛乳中A2型β-酪蛋白（A2奶）检测技术规程

1范围

本标准规定了的牛奶和奶粉中A2型β-酪蛋白（A2奶）的检测方法。本标准适用于牛奶和奶粉中A2型β-酪蛋白（A2奶）的检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法

GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求GB/Z35959液相色谱-质谱联用分析方法通则

3术语与定义

下列术语和定义适用于本规程。

3.1A2型β-酪蛋白(A2β-casein；A2CSN2)

β-酪蛋白由224个氨基酸（含有15个氨基酸的信号肽）组成，具有不同的变体型（A1、A2、A3、

B、C、E、F、H1、I），当第51位、52位、82位、103位、108位、121位、137位、167位氨基酸分别为谷氨酸、谷氨酸、脯氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、丝氨酸、脯氨酸时，称为A2型β-酪蛋白。

3.2A2奶（A2milk）

所含β-酪蛋白为A2型的牛奶称为A2奶。

3.3质谱法（Massspectrometry;MS）

试样被电离后，形成不同质荷比的离子，根据这些离子的质量数和相对丰度分析试样的方法。

3.4质荷比（Mass-to-chargeratio）

离子的质量m与其所带的电荷数z之比，以m/z表示。

4检测原理

β-酪蛋白变体型对应不同的氨基酸突变位点（p.51EK、p.52EK、p.82PH、p.103LI、p.108ML、p.121HQ、p.137SR、p.167PL）（参考序列：GenBankAAA30431.1），而不同氨基酸之间存在分子量差异。利用质谱分析技术，根据质荷比差异将样品蛋白质中存在氨基酸突变的肽段鉴定出来，从而确定氨基酸突变位点，实现对不同突变体型β-酪蛋白检测的目的。

5主要试剂配制

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实验所用水为符合GB/T6682规定的双蒸水；高压灭菌条件为121℃,1.034*105Pa压力，蒸汽灭菌20min。试剂配制见附录A。

6主要仪器设备

见附录B。

7质谱检测及数据处理参数

见附录C

8检测方法

8.1样本采集

8.1.1待检测的新鲜牛奶

每头奶牛采集新鲜牛奶（排除头奶或末乳）50mL，充分混匀后，-80℃保存。

8.1.2待检测的商品化奶粉

包装未开封，常温储存。

8.2蛋白提取

8.2.1从-80℃取出牛奶样本，常温解冻后充分混匀，取样50μL，或称取奶粉样本30mg。

8.2.2向上述样品中加入500μL裂解液【8M尿素，30mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）】。冰上裂解10min。离心，4℃,20000g，30min。取上清，避免吸到油脂。

8.2.3加入二硫苏糖醇（DTT）至终浓度10mM。56℃水浴1h。取出后，迅速加入碘乙酰胺（IAM）至终浓度55mM，暗室静置1h。

8.2.4使用考马斯蓝染色法（bradford法）对蛋白质进行定量。

8.2.5对定量后的蛋白质进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）鉴定（如附录C.1）。

8.3蛋白质的消化

8.3.1每个样品取20μg蛋白，加入到10K超滤管中，14000g，4℃,离心40min，弃废液。

8.3.2加入200μL的25mM碳酸氢铵（NH4HCO3），14000g，4℃,离心40min，弃废液。

8.3.3重复上述步骤两遍

8.3.4加入1μg/μL的胰蛋白酶（Trypsin）和V8蛋白酶（Glu-C）各1μL，37℃水浴24h。离心收集消化后的肽段。

8.3.5真空抽干消化后的肽段。

8.3.60.1%甲酸（FA）复溶肽段。

8.4质谱鉴定

8.4.1将肽段上机检测。使用Q-Exactive四级杆-静电场轨道阱质谱仪检测肽段信号，液相及质谱检测参数详见附录C表C.1、表C.2、表C.3。

8.4.2质谱扫描完毕，得到质谱原始文件，将质谱原始文件输入到PD（ProteomeDiscoverer1.3，Thermo