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牛亲子鉴定技术规程

1范围

本标准规定了牛亲子鉴定的技术方法。本标准适用于牛亲子鉴定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法

NY/T1672绵羊多胎主效基因FecB分子检测技术规程SN/T1193基因检验实验室技术要求

SN/T1917牛地方流行性白血病聚合酶链式反应操作规程

3术语与定义

下列术语和定义适用于本规程。

3.1亲子鉴定（parentageidentification）

利用分子遗传学、生物学及医学的理论和技术判断亲代与子代是否具有血缘关系。

3.2亲权指数（paternityindex，PI）

假设亲代提供生父（母）基因成为孩子生父（母）的可能性和随机亲代提供生父（母）基因成为孩子生父（母）的可能性比值。

3.3LOD值

亲权指数的对数值

3.4亲权（父、母）相对机会（Relativechancepaternity,RCP）

表示疑似亲代是真实亲代的机会。RCP的计算：

RCP=......................

式中：

PI--亲权指数。

多个标记累计的RCP计算：

累计RCP=1-Σ........................

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式中：

RCPi--第i标记的RCP.

3.5微卫星（DNAmicrosatellite）

也称短串联重复序列（STR）或简单重复序列（SSR）。是一类广泛存在于真核生物基因组中的，核心序列为2~6bp，重复次数通常为15~30次的DNA串联重复序列。

3.6多重聚合酶链反应（multiplexPCR）

又称多重引物PCR或复合PCR，是指在同一PCR反应体系中加入两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。

4鉴定原理

利用常染色体微卫星分型技术，选取不同染色体上的微卫星位点，采用多重PCR技术扩增微卫星标记，检测微卫星位点的遗传多态性，分型得出各位点等位基因的大小，通过软件统计分析，确定或排除亲子关系。

5主要试剂配制

除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682的双蒸水；高压灭菌条件为1.034*105Pa压力，蒸汽灭菌20min.试剂配制见附录A。

6主要仪器设备

见附录B。

7检测方法

7.1样本采集

静脉采集血样3~5mL，ACD抗凝，4℃或-20℃保存。对公牛，亦可采集2~3剂细管精液，液氮保存。

7.2DNA提取

7.2.1血液DNA的提取

用酚-氯仿抽提法从抗凝血和血凝块中提取基因组DNA。抗凝血和血凝块的处理按照SN/T1917的规定执行。DNA的提取按照NY/T1672中的规定执行。也可用商业化提取试剂盒提取DNA。

7.2.1精液DNA提取

从细管中取出精液放入1.5mL离心管中，然后，加入50uL生理盐水，混匀，12000rpm离心1min，弃除上清液，保留底部的白色沉淀。重复上述步骤一次。加入精子DNA抽提液400uL及5uL蛋白酶K，旋涡混合器悬浮；56℃消化10～12h，至溶液澄清透明；加入300uL苯酚，轻轻混匀，1200rpm离心10min；小心吸取上清液，转至1.5mL离心管中，加入150uL酚和150uL氯仿，轻轻混合5min;吸取上清液，加入500uL无水乙醇(4℃保存)，轻轻颠倒混合；用灭菌枪头将白色沉淀挑出，1mL的70％乙醇洗

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涤，凉干，加入400uL双蒸水，充分溶解，4℃或-20℃保存。

7.3DNA浓度和纯度检测

按照NY/T1672的规定执行。

7.4引物序列

引物序列参考联合国粮农組织(FAO)和国际动物遗传学会(ISAG)的推荐引物。选取11个具有高度多态性的位于常染色体的微卫星标记，具体见附录C。

7.5PCR扩増

7.5.1多重PCR扩増体系

同一扩増组合的引物加入同一PCR反应管中，25uL反应体系:10*Buffer2.5uL、50mmol/LMgCl2

1.2uL、10mmol/LdNTP0.6uL、TaqDNA聚合醇2uL、10umol/L引物(扩増组合)各1.0uL、待测个体模板DNA(或