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液相色谱串联质谱法测定饲料及谷物中7种真菌毒素的方法

一、1.样品前处理

(1)样品前处理是液相色谱串联质谱法测定饲料及谷物中真菌毒素的关键步骤之一。首先，需要对样品进行称量和混合，以确保样品的均一性。以玉米样品为例，通常需要称取约20g的样品，并充分混合以消除样品内部的差异。在混合过程中，可以使用研钵和研杵进行手工研磨，或者使用高速混合器进行机械混合。混合后的样品需通过四分法进一步缩减至约5g，以便于后续的提取操作。

(2)在提取过程中，根据样品的性质和真菌毒素的种类，可以选择不同的提取溶剂和提取方法。例如，对于玉米样品中的赭曲霉毒素A，常用的提取溶剂包括乙腈、甲醇和水的混合溶液。提取方法有超声提取、振荡提取和微波辅助提取等。以超声提取为例，将提取溶剂与样品混合后，放入超声波提取仪中，设定合适的超声时间和功率，使真菌毒素从样品基质中转移到提取溶剂中。以赭曲霉毒素A为例，超声提取的最佳条件为：提取溶剂为乙腈-水（体积比8:2），超声时间为30分钟，功率为300W。

(3)提取完成后，需要将提取液进行净化处理，以去除杂质并提高检测灵敏度。常用的净化方法包括固相萃取（SPE）和液-液萃取（LLE）。以SPE为例，将提取液通过SPE小柱，使用合适的吸附剂（如C18、Oasis等）进行富集。以赭曲霉毒素A为例，使用C18小柱进行净化，洗脱剂为甲醇，洗脱体积为1mL。净化后的样品需要通过旋转蒸发仪浓缩至近干，然后用少量流动相复溶于适当的体积中，以便于后续的液相色谱分析。在实际操作中，样品前处理过程需要严格控制，以避免实验误差和结果偏差。例如，在SPE净化过程中，洗脱剂的选择和洗脱体积的确定对真菌毒素的回收率有显著影响。通过优化实验条件，可以提高真菌毒素的检测灵敏度和准确度。

二、2.仪器与试剂

(1)液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）是测定饲料及谷物中真菌毒素的关键仪器。该系统通常包括一个高效液相色谱仪（HPLC）和一个质谱仪（MS），两者通过电子喷雾电离（ESI）或大气压化学电离（APCI）接口连接。以ThermoScientific的QExactiveMAX为例，该仪器配备有高分辨率和高灵敏度，适用于复杂样品的分析。例如，在检测玉米中的赭曲霉毒素A时，QExactiveMAX质谱仪的分辨率可达到120,000，能够提供高精度的质荷比（m/z）测量。

(2)用于LC-MS/MS分析的试剂包括色谱级有机溶剂、水、酸碱调节剂和内标。色谱级有机溶剂如乙腈和甲醇用于样品提取和洗脱，要求纯度达到99.9%以上。水作为流动相的一部分，需要去离子水或超纯水，电阻率应达到18.2MΩ·cm以上。酸碱调节剂如磷酸、醋酸等，用于调整流动相的pH值，以优化分离效果。内标物质通常选用已知浓度的标准品，用于校正定量分析的准确性和精密度。例如，在测定玉米中的黄曲霉毒素B1时，可以使用D8-黄曲霉毒素B1作为内标。

(3)实验室中还需配备辅助设备，如离心机、涡旋混合器、旋转蒸发仪和氮气吹扫仪等。离心机用于样品提取后的分离和沉淀，涡旋混合器用于样品和提取溶剂的充分混合，旋转蒸发仪用于样品浓缩和溶剂去除，氮气吹扫仪用于在样品分析前将残留溶剂吹扫干净。以分析玉米中的呕吐毒素为例，使用离心机以4000rpm的速度离心10分钟，然后使用涡旋混合器混合样品和提取溶剂，使用旋转蒸发仪在40°C下浓缩至近干，最后用氮气吹扫仪在50°C下吹扫至干。这些仪器的正确使用对于保证实验结果的准确性和重现性至关重要。

三、3.液相色谱串联质谱法操作步骤

(1)液相色谱串联质谱法测定饲料及谷物中真菌毒素的操作步骤如下。首先，将样品前处理后的溶液用0.22μm滤膜过滤，确保样品无颗粒物。然后，将过滤后的溶液注入高效液相色谱仪。色谱柱选用C18柱，柱温设置为30°C，流动相为乙腈-水（体积比80:20），流速为0.5mL/min。在进样前，需要将样品溶液在室温下平衡至少30分钟。以检测玉米中的赭曲霉毒素A为例，保留时间为10分钟，在此期间，质谱仪的扫描方式为多反应监测（MRM），扫描范围为m/z321.1→162.1和m/z321.1→286.1。

(2)在质谱分析过程中，首先设置电喷雾电压为3.5kV，扫描方式为MRM，碰撞能量为20eV。为了提高检测灵敏度，可以使用碰撞池技术（碰撞池温度设置为200°C）。质谱仪的扫描范围为m/z100-1000，以覆盖所有可能存在的真菌毒素。在分析过程中，需要监控质谱仪的灵敏度、重复性和稳定性。以玉米样品中赭曲霉毒素A的检测为例，通过优化MRM参数，可以实现最低检测限（LOD）为1ng/g的检测能力。

(3)数据采集完成后，使用色谱工作站对数据进行处理和分析。首先，对MRM数据进行分析，确定样品中目标真菌毒素的存