忍冬组培体系构建与LjTTG1表皮毛基因功能研究.pdfVIP

摘要

忍冬（LonicerajaponicaThunb.）是忍冬科忍冬属多年生藤本植物，金银花是忍冬

的干燥花蕾或带初开的花，味干性寒，具有清热解毒、疏散风热的功效。忍冬栽培生

产中由于长期的无性繁殖和无序引种，造成忍冬品种退化混杂、病虫害严重引起产量

和品质下降等问题，因此进行忍冬分子辅助育种具有重要意义。忍冬特异性状研究是

分子辅助育种的关键环节，对特异性状功能基因的研究将为忍冬创新种质提供良好的

基因储备。豫金1号表皮毛密且长、豫金2号花蕾为紫红色是本课题组选育的具有显

著特异性状的新品种，前期对豫金1号和封金1号花发育的七个花期进行转录组测序

比较分析筛选得到了调控表皮毛发育的LjTTG1基因。在此基础上，为进一步研究

LjTTG1基因的功能，本实验对豫金1号和豫金2号进行组织培养体系构建，为忍冬同

源转化验证LjTTG1基因功能奠定技术和物质基础，同时进行拟南芥异源转化初步验证

了LjTTG1表皮毛基因的功能。

主要研究结果如下：

1.豫金1号和豫金2号组织培养体系构建

(1)建立了豫金1号和豫金2号初代无菌体系

以顶芽为外植体，75%的酒精消毒30s后，豫金1号用0.1%的升汞消毒8min，接

种于MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L初代培养基上培养，30d后无菌苗得率89.4%，

腋芽诱导率为100%；豫金2号用0.1%的升汞消毒6min，接种于MS+6-BA0.5

mg/L+NAA0.1mg/L初代培养基中，30d后无菌苗得率82.6%，腋芽诱导率为86.32%。

为快繁体系奠定了基础。

(2)建立了豫金1号和豫金2号快繁体系

豫金1号的最佳的增殖培养基为WPM+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L，增殖系数

可达4.48；最佳生根培养基为WPM+IBA0.1mg/L，生根率可达94.44%且根系较为粗

壮发达。豫金2号最佳的增殖培养基为WPM+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L，增殖系

数可达4.16；最佳生根培养基为WPM+IBA0.1mg/L，生根率可达90.87%，根数多且

长。将豫金1号和豫金2号移栽于营养土和蛭石比例为1：1的培养基质中，用保鲜膜

保湿三天后慢慢揭去，移栽成活率可达100%。为忍冬再生体系奠定了基础。

(3)获得了豫金1号和豫金2号叶片愈伤组织

豫金1号和豫金2号愈伤组织诱导的最佳培养基为MS+6-BA1.5mg/L+KT0.75

mg/L+NAA0.2mg/L，愈伤组织诱导率为94%，生长状态呈黄绿色、疏松状。为忍冬

再生芽分化奠定基础。

(4)探索了豫金1号和豫金2号愈伤组织再分化培养基

将长势良好的愈伤组织接种到分化培养基中培养，豫金1号在MS+6-BA2.5

mg/L+KT2.5mg/L+NAA0.2mg/L中愈伤组织生长状态最好，豫金2号在MS+6-BA

2.5mg/L+KT0.5mg/L+NAA0.3mg/L愈伤组织生长状态最好，但二者均未有再生芽发

生。在此结果基础上设计6-BA浓度为2.5、3.0mg/L，KT0.5、1.0、2.0、3.0mg/L，

NAA0.2、0.3、0.4mg/L的愈伤组织再分化优化培养基。为忍冬再生芽分化和再生苗发

生奠定基础。

2.LjTTG1表皮毛基因功能验证

(1)克隆和分析了LjTTG1表皮毛基因

以忍冬RNA反转录得到的cDNA为模板，克隆得到忍冬LjTTG1基因。该基因的

编码区全长1023bp，共编码341个氨基酸；对其蛋白结构域预测，结果显示该基因存

在4个WD40重复蛋白，属于WD40蛋白家族；其同源性序列对比和进化树分析显示

该蛋白与麻风树(JatrophacurcasL.)JcTTG1同源性最高、亲缘关系最近。

(2)获得了拟南芥遗传转化植株

构建植物过表达载体pCaMV35S-LjTTG1，对拟南芥进行