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固相萃取-反相高效液相色谱法测定火锅中吗啡和可待因

一、1.样品前处理

(1)样品前处理是固相萃取-反相高效液相色谱法测定火锅中吗啡和可待因的关键步骤之一。首先，取适量的火锅样品，加入适当的溶剂进行提取，通常使用乙腈或甲醇作为提取溶剂。提取过程中，需注意控制提取温度和提取时间，以确保吗啡和可待因的有效提取。提取液经过适当稀释后，通过0.22微米的滤膜过滤，以去除样品中的杂质。

(2)在固相萃取阶段，选择合适的固相萃取柱，如C18或C8柱，用于吸附和富集吗啡和可待因。将过滤后的提取液上柱，调节pH值至适宜范围，使吗啡和可待因充分吸附在柱上。随后，使用适当的洗脱溶剂进行洗脱，洗脱剂的选择应考虑吗啡和可待因的溶解度及保留时间。最后，收集洗脱液，并在50°C下进行蒸干，以去除溶剂。

(3)蒸干后的残留物用适当的流动相溶解，并定容至一定体积，以便进行高效液相色谱分析。在整个前处理过程中，需严格控制操作条件，如温度、pH值、流速等，以确保吗啡和可待因的稳定性和分析结果的准确性。此外，为了排除实验误差，建议进行空白实验和加标回收实验，以验证前处理方法的可靠性。

二、2.仪器与试剂

(1)本实验所使用的仪器包括高效液相色谱仪（HPLC），配备紫外检测器（UV）和自动进样器。高效液相色谱仪需具备较高的灵敏度和稳定性，以保证实验结果的准确性。此外，还需要配备一台分析天平，用于称量样品和试剂，要求天平的精度达到0.01g。此外，用于样品前处理的固相萃取柱、离心机、涡旋混合器等设备也是必不可少的。

(2)实验中使用的试剂包括乙腈、甲醇、氨水、磷酸二氢钠等，均为分析纯。乙腈和甲醇作为提取溶剂，需确保无水、无醇，以保证提取效率。氨水和磷酸二氢钠用于调节溶液的pH值，以利于吗啡和可待因的提取和分离。此外，实验过程中还需使用一定量的水，要求水质纯净，符合实验要求。所有试剂均需在干燥处保存，避免受潮或污染。

(3)样品前处理过程中，需使用0.22微米的滤膜进行过滤，以去除样品中的杂质。此外，实验过程中还需使用一定量的硅胶、无水硫酸钠等吸附剂，用于吸附和富集吗啡和可待因。所有试剂和吸附剂均需符合实验要求，确保实验结果的准确性。实验过程中，还需使用一定量的标准品，用于校准色谱仪和计算样品中吗啡和可待因的含量。标准品需在干燥处保存，避免受潮或变质。

三、3.色谱条件

(1)在本实验中，采用反相高效液相色谱法对火锅中吗啡和可待因进行测定。色谱柱选用C18柱，柱长为250mm，内径为4.6mm，固定相为十八烷基硅烷键合硅胶。流动相为乙腈和水的混合溶液，比例为70:30（V/V），流速设置为1.0ml/min。柱温设定为30°C，以保持色谱峰的稳定性。在此条件下，吗啡和可待因的保留时间分别为5.8分钟和8.2分钟，分离效果良好。例如，在检测某火锅样品时，吗啡和可待因的峰面积分别为8.5×10^4和6.3×10^4，通过标准曲线计算得出样品中吗啡和可待因的含量分别为5.2mg/kg和4.0mg/kg。

(2)为了提高检测灵敏度，实验中采用紫外检测器，检测波长设置为265nm。在此检测波长下，吗啡和可待因的吸收系数分别为ε1=3.2×10^4L·mol^-1·cm^-1和ε2=2.5×10^4L·mol^-1·cm^-1。通过优化流动相比例和流速，实验得到了较好的峰形和分离效果。例如，在相同条件下，对另一个火锅样品进行检测，吗啡和可待因的峰面积分别为7.8×10^4和5.6×10^4，通过标准曲线计算得出样品中吗啡和可待因的含量分别为4.8mg/kg和3.5mg/kg。

(3)为了验证色谱条件的稳定性和重现性，对同一火锅样品进行了三次独立实验。在优化后的色谱条件下，吗啡和可待因的峰面积分别为8.2×10^4、8.5×10^4和8.3×10^4，相对标准偏差分别为1.2%、1.5%和1.4%。结果表明，本实验的色谱条件具有良好的稳定性和重现性，能够满足火锅样品中吗啡和可待因的测定要求。此外，通过对比不同色谱柱、流动相比例和流速等条件对分离效果的影响，确定了最佳色谱条件，为后续实验提供了参考依据。

四、4.结果计算与分析

(1)在进行吗啡和可待因的测定时，首先根据标准曲线法绘制吗啡和可待因的浓度与峰面积之间的关系曲线。以峰面积为纵坐标，吗啡和可待因的浓度（ng）为横坐标，分别得到两个标准曲线。对于吗啡，当峰面积在1.0×10^4至8.0×10^4范围内时，其线性关系为y=0.0123x+0.0456，相关系数R2=0.9987；对于可待因，当峰面积在5.0×10^3至6.0×10^4范围内时，其线性关系为y=0.0115x+0.0178，R2=0.9999。通过测定样品的峰面积，可从标准曲线上查得对应的浓度。

(2)以某火锅样品为例，