枯草杆菌摇瓶发酵生产淀粉酶 (2).ppt

实验仪器及试剂仪器：分光光度计、恒温水浴锅（控温精度±0.1℃）、移液管、试管、烧杯、容量瓶、玻璃棒、秒表。第37页,共41页，星期六，2024年，5月试剂及溶液试剂：碘、碘化钾、α-淀粉酶制剂、磷酸氢二钠、柠檬酸、盐酸、可溶性淀粉（湖州展望化学药业有限公司）。溶液配制：原碘液：称取11.0g碘和22.0g碘化钾，用少量水使碘完全溶解，定容至500mL，贮存于棕色瓶中。稀碘液：吸取原碘液2.00mL，加20.0g碘化钾用水溶解并定容至500mL，贮存于棕色瓶中。第38页,共41页，星期六，2024年，5月试剂及溶液溶液配制：可溶性淀粉溶液(20g/L)：称取2.000g(精确至0.001g)可溶性淀粉(以绝干计)于烧杯中，用少量水调成浆状物，边搅拌边缓缓加入70mL沸水中，然后用水分次冲洗装淀粉的烧杯，洗液倒人其中，搅拌加热至完全透明，冷却定容至100mL。溶液现配现用。磷酸缓冲液(pH=6.0)：称取45.23g磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)和8.07g柠檬酸(C6H8O7·H2O)，用水溶解并定容至1000mL。用pH计校正后使用。盐酸溶液：c(HCI)=0.1mol/L。第39页,共41页，星期六，2024年，5月实验方法待测酶液的制备：称取1g~2g酶粉(精确至0.0001g)或准确吸取酶液1.00mL，用少量磷酸缓冲液充分溶解，将上清液小心倾入容量瓶中，若有剩余残渣，再加少量磷酸缓冲液充分研磨，最终样品全部移入容量瓶中，用磷酸缓冲液定容至刻度，摇匀。用四层纱布过滤，滤液待用。注:待测中温a-淀粉酶酶液酶活力控制酶浓度在3.4u/mL~4.5u/mL范围内，待测耐高温淀粉酶活力控制酶浓度在60u/mL~65u/mL范围内。第40页,共41页，星期六，2024年，5月酶活力测定吸取10.0mL可溶性淀粉溶液于试管中，加入磷酸缓冲液2.5mL，摇匀后，置于60℃±0.2℃(耐高温α-淀粉酶制剂置于70℃±0.2℃)恒温水浴中预热8min；加入0.5mL稀释好的待测酶液，立即计时，摇匀，准确反应5min；立即用移液管吸取1.0mL反应液，加到预先盛有0.5mL盐酸溶液和5.00mL稀碘液的试管中，摇匀，并以0.5mL盐酸溶液和5.00mL稀碘液为空白，于660nm波长下，用10mm比色皿迅速测定其吸光度(A)。根据吸光度查表A.1，求得测试酶液的浓度。第41页,共41页，星期六，2024年，5月产酶工艺条件及其调节控制保藏细胞细胞活化细胞扩大培养发酵产酶分离纯化酶固定化细胞原生质体固定化原生质体培养基预培养无菌空气第5页,共41页，星期六，2024年，5月酶制剂的发酵生产过程图解第6页,共41页，星期六，2024年，5月30升全自动发酵罐第7页,共41页，星期六，2024年，5月第8页,共41页，星期六，2024年，5月第9页,共41页，星期六，2024年，5月发酵工艺参数的控制pH的调节控制温度的调节控制溶解氧的调节控制泡沫的控制染菌的控制第10页,共41页，星期六，2024年，5月酶的提取与分离纯化的工艺流程发酵液预处理（细菌絮凝）固液分离（离心、过滤）菌体（胞内酶）动植物源酶液体（胞外酶）细胞破碎提取固液分离液体第11页,共41页，星期六，2024年，5月工业、食品、饲料浓缩（蒸发、超滤、沉淀）浓缩液配方干燥医药、分析、科研液体酶固体酶浓缩分离纯化（离心、沉淀、膜分离、层析、电泳、萃取、结晶）配方、制剂干燥液体酶固体酶第12页,共41页，星期六，2024年，5月酶活力的测定酶活力：也称酶活性，酶催化一定化学反应的能力。酶活力大小可用在一定条件下，它所催化的某一化学反应的起始速率V0表示，即用反应起始阶段产物增加(或底物减少)的速率表示。v=-dS/dt=dP/dt第13页,共41页，星期六，2024年，5月酶活力测定方法酶活力测定的要求：快速、简便、准确。包括两个阶段：1、将酶与反应底物混合均匀，在一定条件下反应一段时间；2、测定反应液中底物或产物的变化量。第14页,共41页，星期六，2024年，5月酶活力测定的基本步骤：(1)根据酶催化的专一性，选择适宜的底物，并配制成一定浓度的底物溶液。(2)根据酶的动力学性质，确定酶催化反应的温度、pH值、底物浓度、激活剂浓度等反应条