枯草芽孢杆菌产淀粉酶好氧实验报告.docx

《生物工程专业综合实验2》

——好氧发酵

实

验

报

告

班级

：

学号

姓名

：

完成日期

：2025年1月05日

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目录

TOC\o1-3\h\z\u枯草芽孢杆菌产淀粉酶好氧发酵 2

一、实验目的 2

二、实验原理 3

三、实验仪器设备配制 3

四、实验材料与试剂 3

五、实验操作 4

六、淀粉酶活力测定 4

七对影响产酶因素的探索 5

八、此报告实验条件 5

九、实验结果记录与分析 6

淀粉碘液法标准曲线的绘制 6

不同温度下，OD600菌体浓度的记录数据，绘制生长曲线图 6

不同温度下，检测发酵液淀粉酶活力，记录数据，绘制酶活动力曲线图 8

枯草芽孢杆菌产淀粉酶好氧发酵

淀粉酶是一种广泛应用的工业酶，它能够催化淀粉分解成糊精、麦芽糖和葡萄糖等可溶性糖类，这一过程在食品加工、饲料生产、纺织工业和生物燃料等领域具有重要意义。淀粉作为地球上最丰富的碳水化合物资源，其高效转化对于提高资源利用率和促进可持续发展具有重要作用。枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）是一种广泛存在于自然界中的土壤细菌，具有较强的产淀粉酶能力，因此在工业生产中具有很高的应用价值。

草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）是一种革兰氏阳性细菌，广泛分布于土壤、水体和植物表面。它具有以下特性，使其成为工业酶生产的理想菌株：生长速度快：枯草芽孢杆菌能够在较短的时间内达到较高的细胞密度，有利于酶的大量生产。安全性高：枯草芽孢杆菌被认为是一种安全的微生物，不具有致病性，适合用于食品和饲料添加剂的生产。产酶能力强：枯草芽孢杆菌能够分泌多种酶类，包括淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等，其中淀粉酶的产量和活性较高。

耐环境胁迫：枯草芽孢杆菌能够形成芽孢，对抗恶劣环境，有利于工业生产中的菌株保存和运输。

与其他原核微生物表达系统相比，枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis系统具有诸多优势：仅有单层细胞外膜，分泌信号肽效率高，可将外源蛋白质直接分泌至培养基，提高下游纯化效率；广泛用于多种工业酶的生产，发酵技术成熟；非致病性，被列为国际公认的安全微生物（GRAS）；遗传背景清楚，质粒和噬菌体载体类型丰富；密码子偏好性不明显等。

一、实验目的

研究枯草芽孢杆菌在好氧条件下产淀粉酶的特性。

探讨不同发酵条件对枯草芽孢杆菌产淀粉酶的影响。

熟悉摇床耗氧发酵法的工艺流程，了解淀粉–碘液法测定淀粉酶活力和比浊法测定生物量的方法和原理。

在实验中学习基本微生物实验操作技能，强化无菌操作概念。

了解枯草芽孢杆菌发酵时的生长条件及注意事项。

二、实验原理

摇瓶发酵是实验室常用的通风发酵方法，通过将装有液体发酵培养基的摇瓶放在摇床上振荡培养，以满足微生物生长、繁殖及产生代谢产物对氧的需求。它是实验室筛选好气性菌种，以及摸索种子培养工艺与发酵工艺的常用方法。

α-淀粉酶属水解酶，作为生物催化剂可随机作用于直链淀粉分子内部的α-1,4糖苷键，迅速地将直链淀粉分子切割为短链的糊精或寡糖，使淀粉的粘度迅速下降，淀粉与碘的反应逐渐消失。本实验通过淀粉遇碘显蓝色，淀粉含量越高，颜色越深。用分光光度计检测显色效应大小，通过分光光度值计算酶活力。

比浊法又称浊度测定法，原理是悬浮颗粒在液体中造成透射光的减弱，减弱的程度与悬浮颗粒的量相关，据此可定量测定物质在溶液中呈悬浮状态时浓度的方法。也就是利用培养液中微生物的数量不同造成的吸光度差异来确定微生物的生长量。比浊法和比色法所依据的原理是相同的，实验方法也相似。通常，比色计或分光光度计都可用于比浊分析。

三、实验仪器设备配制

1、恒温培养箱；2、控温摇床；3、高压蒸汽灭菌锅；4、超净工作台；5、可见光分光光度计；6、高速离心机；7、电子天平；8、鼓风干燥箱。

四、实验材料与试剂

4.1、菌种

枯草芽孢杆菌：安徽工程大学微生物与生物化学实验室保藏菌株。

4.2、培养基

种子培养基：LB培养基（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl5，pH7.0

发酵培养基：TB培养基（g/L）：蛋白胨12，酵母粉24，可溶性淀粉1.2g，KH2PO42.32g，K2HPO4·3H2O16.43g，pH7.0。

五、实验操作

5.1倒LB平板

每小组分别配制LB液体、LB固体培养基各50ml备用；LB固体培养基倒2块平板备用。

5.2菌种活化

将枯草芽孢杆菌菌种划线于LB固体培养基中，37℃培养24h，观察是否有单菌落长出。

5.3预培养

从过夜培养的LB平板上挑取3各单菌落分别于盛有5mlLB液体培养的试管中，37℃培养24h。

5.4扩大培养

按1%接种量，将试管中过夜培养