DB21T 3273-2020 猪伪狂犬病毒野毒株与gE基因缺失疫苗株TaqMan实时荧光定量PCR鉴别方法　　.docxVIP

ICS11.220B41

DB21

辽宁省地方标准

DB21/T3273—2020

猪伪狂犬病毒野毒株与gE基因缺失疫苗株TaqMan实时荧光定量PCR鉴别方法

ATaqManReal-timePCRMethodforDifferentiationofWild-typeStrainfromgE-deletedVaccineStrainofPseudorabiesVirus

2020-06-30发布2020-07-30实施

辽宁省市场监督管理局发布

DB21/T3273—2020

I

目次

前言 II

1范围 1

2规范性引用文件 1

3缩略语 1

4仪器和耗材 1

5试剂和材料 1

6样品采集、处理和运输 2

7荧光qPCR操作程序 3

8结果判定 4

附录A（规范性附录）溶液配制 6

附录B（规范性附录）引物和探针 7

DB21/T3273—2020

II

前言

本标准根据GB/T1.1-2009的有关规定进行制定。本标准由辽宁省农业农村厅提出并归口管理。

本标准负责起草单位：辽宁省农业发展服务中心。

本标准起草人：兰德松、顾贵波、周维、杨洺扬、李可心、孙世宇、张健、刘贺、李旭、高原、丁静。

本标准发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈，我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。

归口管理部门通讯地址：辽宁省农业农村厅（沈阳市和平区太原北街2号），联系电话：024标准起草单位通讯地址：辽宁省农业发展服务中心（沈阳市皇姑区宁山东路29号），联系电话：

024DB21/T3273—2020

1

猪伪狂犬病毒野毒株与gE基因缺失疫苗株TaqMan实时荧光定量PCR鉴别方法

1范围

本标准规定了猪伪狂犬病毒（pseudorabiesvirus,PRV）野毒株及gE基因缺失毒株的TaqMan荧光PCR检测方法。

本标准适用于猪血液、组织脏器、精液、鼻腔拭子和细胞培养物等材料中PRV核酸的检测以及PRV野毒株与gE基因缺失疫苗株病毒核酸的鉴别检测。

本标准的实验操作应在生物安全II级实验室（BSL-2实验室）中进行。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

3缩略语

下列缩略语适用于本标准。

gD糖蛋白D（glycoproteinD）gE糖蛋白E（glycoproteinE）

PRV伪狂犬病病毒（pseudorabiesvirus）

4仪器和耗材

4.1仪器

荧光PCR仪、高速冷冻离心机（可控温至4℃,离心速度可达12000r/min以上）、组织研磨仪或研钵、自动化核酸提取仪（如选用商品化核酸提取试剂盒）、PCR微量离心机、2℃~8℃普通冰箱、-20℃以下普通冰箱、-70℃以下超低温冰箱、移液器（量程0.1μL～2μL、2μL～20μL、20μL~200μL）。

4.2耗材

无菌无DNA酶的1.5mL离心管、0.2mLPCR反应管或八联管或96孔反应板、与移液器匹配的吸头。

5试剂和材料

DB21/T3273—2020

2

5.1DNAzol?Reagent：商品化DNA提取试剂，2℃~8℃普通冰箱中保存；或商品化核酸提取试剂盒（如磁珠法核酸提取试剂），通常18℃~25℃保存。

5.2无水乙醇：-20℃普通冰箱中预冷。

5.375%乙醇：用无水乙醇和双蒸水配制，-20℃普通冰箱中预冷。

5.4PBS：磷酸盐缓冲液（0.02mol/LpH7.2），配制见附录A。

5.58mmol/LNaOH溶液，配制见附录A。

5.62×TaqManFastqPCRMasterMix：为商品化探针法实时荧光PCR反应专用试剂，包含反应所需的缓冲液、酶、dNTP、Mg+等的预混液，-20℃普通冰箱中保存，避免反复冻融。

5.7引物和TaqMan探针，序列见附