分子生物学常用技术及其应用.ppt

二）.λ-噬菌体(λphage)是一种可在体外包装的细菌病毒,可高效感染大肠杆菌.λ-噬菌体DNA是线状双链DNA分子,全长约50kb,每条链各带12bp长的单链互补末端-粘末端(COS序列)。进入宿主细胞后不久，COS序列碱基配对环化。改建后的λ噬菌体发展了多种较大型的克隆载体，如：置换λ载体–溶解途径插入λ载体–裂解途径载体和外源DNA整合到宿主菌DNA中。可克隆23kb的外源DNA。DNA在宿主细胞中复制，然后包装成噬菌体，裂解宿主，释放噬菌体。可克隆5kb的cDNA。裂解途径（三）.粘粒(cosmidvector)

（30～40kb）是将质粒和λ噬菌体改建的一种载体.它含COS序列,插入一小plasmid–而得名Cosmid。改建后的粘粒含有λ噬菌体的复制起点和cos末端。全长8kb。大片段外源DNA插入后，在体外包装进而被克隆。可包装30～45kb长的DNA片段，多用于基因文库构建。人类和哺乳动物的基因组很大，甚至许多单个基因也相当大（如：DMDgene2300kb），克隆分析就需要更大的基因载体。如近年来构建的一些载体：BAC，PI，YAC等。(四)大片段DNA克隆载体细菌人工染色体（bacterialartificialchromosome,BAC）优点：能携带大片段DNA，约300kb。在每个细胞中，一个载体分子能繁殖多个拷贝，高产DNA。缺点：会出现插入片段在结构上的不稳定，导致克隆DNA部分的缺失或重排。为克服上述缺点，人们采用低拷贝数复制子载体，如，Ecoli中的F因子。此质粒含有2种基因（partA,partB）。每个Ecoli能接受300kbDNA片段。”2、噬菌体PI载体和PACPI噬菌体与λ噬菌体一样，外有蛋白质壳。内含相当大的（110～115kb）线性DNA，并在体外包装于PI壳内。PI进入宿主细胞后环化，扩增。1994年，有人将PI和F因子克隆结合产生PI人工染色体克隆系统-----PAC。3、酵母人工染色体（yeastartificialchromosome,YAC）适用于克隆大片段DNA，0.2～2MbYAC的主要功能成份有三：着丝粒：mitosis姊妹染色单体和减I同源染色体分离之必需。端粒：保护染色体末端免受核酸酶的侵袭。自主复制序列（ARS）元件：是染色体自主复制的复制起点。构建YAC需要4个短序列：2个端粒，着丝粒，ARS元件，与外源DNA连接成线性DNA分子，导入酵母细胞克隆。三、DNA重组与分子克隆化为获得所需的基因或特异序列，需从细胞中分离得到目的基因与载体DNA重组，并用适当方法在宿主细胞中表达，扩增得到大量相同的DNA片段，称为DNA克隆，亦称分子克隆。基本原理与过程：分离纯化目的基因目的基因+vector=重组DNA分子重组DNA分子导入受体细胞，并在其内增殖。筛选含有重组DNA的细胞——细胞克隆（cellclone），将转化的细胞置于琼脂表面，以刺激细胞克隆生长，这些细胞是由单个细胞形成的遗传相同的细胞群体，故称细胞克隆。再将每个克隆移至液体培养基中进行扩增。分离重组DNA克隆：即收获扩增的培养细胞，并选择分离重组DNA。分离纯化目的基因

目的基因+vector=重组DNA分子重组DNA和分子克隆重组DNA和分子克隆的几种方法：

（依目的基因的来源）从基因组中分离目的基因在细胞中克隆由特定mRNA逆转录合成cDNA后再进行克隆化学合成目的基因进行克隆PCR体外扩增目的片段进行克隆从基因组中分离目的基因在细胞中克隆筛选含有重组DNA的细胞——细胞克隆（cellclone）筛查含有目的基因的细胞克隆四、目的基因表达上述细胞的克隆系统可直接导入的目基因扩增，获得足够量的目的基因来进行结构与功能的研究。重组DNA技术的另一目的是获得基因重组后的产物——RNA，蛋白质。就是将目的基因与表达载体重组，导入宿主细胞进而表达出相应的基因产物（蛋白）。如胰岛素，干扰素；生产疫苗的抗原和特异的抗体等。此类克隆系统称为表达克隆。（expressioncloning）.目的基因表达（一）真核细胞的基因在原核细胞

（细菌）中表达

原核细胞中缺乏真核基因表达装置（如，RNA剪接因子等），因此不能直接表达。通常采用大肠杆菌为宿主。真核多肽的表达要求：1）适当的cDNA（完整的编码序列）；2）适当的表达载体，提供特定多肽信息；3）外部进行表达调控，表达系统设计有启动子。?产物特征：1）真核细胞的