原位杂交实验方法.ppt

原理：FISH—Cellscience设计的原位杂交，用以显示组织和细胞中mRNA的分布。探针的3，端标记地高辛，5’端标记荧光素。生物素标记的抗地高辛抗体可以与链霉亲和素标记的过氧化物酶或碱性磷酸酶结合，作用于相应的显色底物DAB或NBT/BCIP，显色为棕黄色或蓝紫色，探针5，端标记的荧光素，可以在荧光显微镜492-549nm时发出黄绿色荧光来显示被检测mRNA之信号。此方法的灵敏度可基本上替代放射同位素标记的探针且具有低背景和操作简便的优点。也可以用于Northern和Southern的检测以及原位PCR。所用试剂准备： 1两端标记寡核苷酸探针干粉ProductNumber:nFISH30ug2寡核苷酸探针稀释液既用型ProductNumber:FISH0012ml3寡核苷酸探针预杂交液既用型ProductNumber:FISH0022ml4复合消化液(P/E)PH:6.4既用型ProductNumber:TSP60446ml5生物素标记的小鼠抗地高辛浓缩型ProductNumber:DB7405B0.1ml6高敏过氧化物酶链亲和素复合物浓缩型ProductNumber:AA7419H0.1ml7DEPCProductNumber:D575810ml8DABKitProductNumber:D56373ml920XSSC干粉1000ml1，无RNA酶水的处理：1000ml去离子水中加入1ml的DEPC（注：DEPC加入水中时应为油珠状，此时才能有效灭活RNA酶）37度搅拌24小时以灭活RNA酶，然后高压消毒降DEPC，备用。（此水为无RNA酶水用以配制原位杂交时所用的溶液。）2，无RNA酶玻片的处理玻片包括盖片和载片应用热肥皂刷洗，自来水清洗干净后，置于清洁液中浸泡24h，清水洗净烘干，95%酒精中浸泡24h后蒸馏水冲洗、烘干，烘箱温度最好在150℃或以上过夜以去除任何RNA酶。盖玻片在有条件时最好用硅化处理，锡箔纸包裹无尘存放。推荐：多聚赖氨酸包被玻片的制备方法（粘片剂均须用无RNA酶水配制）（1）将事先准备好的经160℃以上烘烤，并冷却至室温的玻片（载片或盖片），在0.05%（也有用0.1%）的PLL液中上下浸蘸几下，分散开竖放在架子上，于空气中自然干燥，4℃备用。注意：①浸蘸时，务必使整个玻片完全浸于液体中，否则，包被不完全会产生标本脱落现象；②干燥过程中注意避免尘埃污染；③按上法处理的玻片通常可存放在一定时间（室温1月以上，4℃更长），但仍建议尽早使用。（2）多聚赖氨酸1mg溶于10ml灭菌，无RNA酶的去离子水或1mmol/L的Tris-HCl缓冲液中（pH7.0）将其涂布于玻片上，待干燥后即可使用。该法包被的玻片可用于细胞涂片和切片。（3）将PLL工作液滴至盖玻片上5μl/片，用另一盖玻片以推血涂片方法推片，或用另一盖玻片紧贴于其上，相互磨擦以使两盖玻片相对的一面涂布上PLL。该法制备的玻片，只有一面是包被有PLL，故制备时，待其晾干后，应作好记号，然后保存后备用。多聚赖氨酸可用于多种核酸杂交，方法简单，结果可靠，有许多其它方法不可