医学分子生物学实验技术.ppt

**梯度洗脱：在梯度活脱中缓冲液的洗脱能力是逐渐的连续的加强。在梯度洗脱的条件下，同种组分中那些因为吸附较紧密而落在后面的分子，会因为洗脱能力的逐步加强而赶上前面的分子，克服了阶段洗脱中的拖尾现象和假峰。同时，混合物中的各个组分将逐个地进入解吸状态，而被逐次洗脱为峰形对称的各个清晰层析谱峰，分辨力大大超过阶段洗脱。**连续梯度的形式及连续梯度的建立****缓冲液的选择对缓冲液pH的选择：决定于被分离物质的等电点、稳定性和溶解度，也要根据交换纤维素解离基团的pK值。用阴离子交换纤维素时要选用低于其pK值的缓冲液，用阳离子交换纤维素则要选用高于其pK值的缓冲液。pH值一经选定，便限制了缓冲液种类选择。适用于不同pH范围的一些常用缓冲液种类如下表：**常用缓冲液种类**3.1.2缓冲液的选择为了获得足够的缓冲容量，选用的缓冲离子，其pK值要尽量接近起始缓冲液的pH值(最好约在0.5个pH单位之内)。这样可降低因缓冲液离子与离子交换纤维素的相互作用和由吸附过程本身所引起的pH紊乱。否则会出现pH的交错界面而形成假峰。**3.1.2缓冲液的选择适宜的缓冲液必须在所选择的pH范围内有足够的缓冲能力，而且必须不影响目的物的活性，并且不干扰洗脱液的分析。如用紫外吸收法来分析洗脱液中的蛋白质和核酸含量时不能选用含芳香族化合物(如吡啶、巴比妥)的缓冲液。而假如用215－225nm波长光测吸收进行分析时，则不能用含有羧基的缓冲液。选用的缓冲液也必须不影响样品的溶解性或与一些活性保护剂(如Ca＋＋、Mg＋＋)等生成沉淀。**3.1.2缓冲液的选择用阳离子交换纤维素时一般应使用阴离子型缓冲液(如磷酸、醋酸等)，而用阴离子纤维素时则应使用阳离子型缓冲液(如Tris，吡啶等)，以避免缓冲液离子被吸附而形成人为的pH和盐浓度交错界面。01为了结合尽可能多的样品，起始缓冲液的离子强度一般较低，为0.001~0.01M。当用增加离子强度进行洗脱时，为使层析系统尽可能地单一，可以用单纯增加缓冲液离子浓度的办法来达到，这样便于控制pH。01**3.1.2缓冲液的选择当需要将洗脱液分部干燥后测量放射性时，残渣中的盐会妨碍放射性的正常测量或分离较小的分子时去盐也常常出现困难，在这些情况下可选用挥发性缓冲液。在进行某些容易丢失活性的物质的层析分离时，缓冲液中可适当加入保护剂，如巯基保护剂：半胱氨酸、巯基乙醇；螯合剂：EDTA、甘氨酸；无机离子等。12**洗脱液按一定的体积分别收集后逐管进行分析，最后将分析结果对收集管号作图。**洗脱峰纯度鉴定理论上应出现一个对称的峰，但实际上吸附层析得到的峰几乎都有拖尾现象。鉴定可用圆盘电泳和凝胶过滤法。01分析分为两种类型：1、非特异性分析，反映各组分的分离情况；2、特异性分析，反映目的物的具体位置。02**DEAE纤维素柱层析分离甘露醇脱氢酶3.6应用实例**DEAE纤维素柱上的层析分离人血清免疫球蛋白的分离情况**兔γ－球蛋白的木瓜蛋白酶水解物在CM纤维素柱上的层析分离**logo天花粉各成分用特种离子交换剂层析分离****logo天花粉各成分用特种离子交换剂层析分离****E.Coli核酸在甲基血清白蛋白硅藻土层析柱上的分部分离情况****蛋白质的层析分离添加标题层析的分类添加标题离子交换层析添加标题分配层析添加标题分子筛（凝胶过滤）层析添加标题吸附层析添加标题亲和层析**层析技术的基本原理任何一种层析技术都由互不相溶的两相组成，分别称为固定相和流动相。被分离的物质由于其本身的物理性质或化学性质的不同，在两相中的分配系数（溶解度）不同，经过一定的时间后，混合在一起的物质彼此实现分离。Ｋ＝＝溶质在固定相中的浓度溶质在流动相中的浓度CsCm********迁移率(Rf)：层析过程中，样品移动的相对速率或相对距离。abRf==溶质斑点中心移动的距离溶剂前沿移动的距离ab滤纸前沿原点影响Rf值的主要因素物质的结构和极性的影响：一般来说，物质分子中极性基团增加，物质的极性就随着增加，则分配系数变大，Rf值变小。而分子中(-CH2-)增加分子极性变小，Rf值相应变大。**常用参数：1/2h607h**如图所示为一色谱流出曲线：**A基线：在正常的操作条件下，仅有流动相（无被分离样品）通过检测器时所产生的信号。B层析峰：样品从洗脱开始到样品流出层析柱时，检测器对层析样品和层析时