脂肪肝细胞源外泌体通过GRP78调节草鱼肝细胞脂质代谢的研究.pdfVIP

摘要

集约化养殖模式的推广和高脂饲料的广泛应用，极易导致养殖鱼类肝脏脂质蓄积进

而形成脂肪肝。因此，寻找新的调节脂质代谢的有效因子十分重要。研究发现，外泌体

（Exosomes）可通过携带miRNAs，核酸和蛋白质等调节脂质代谢进而影响受体细胞的

功能。葡萄糖调节蛋白78（Glucoseregulatedprotein78，GRP78）参与了内质网应激诱

导的脂质代谢紊乱的调节。但草鱼（Ctenopharyngodonidella）脂肪肝细胞源外泌体

（Exosomesderivedfromfattyhepatocytes，OA-Exo）是否通过GRP78调节肝细胞脂质

代谢尚不清楚。因此，本实验以草鱼肝细胞为材料，通过生化指标测定、油红O染色、

免疫荧光、实时荧光定量（RealtimequantitativePCR，RT-qPCR）、蛋白质免疫印迹

（WesternBlot，WB）等分子和细胞生物学实验技术，探究草鱼脂肪肝细胞源外泌体和

GRP78在肝细胞脂质代谢中的作用及调节机制。研究结果为进一步认识外泌体和GRP78

在鱼类脂质代谢中的作用提供了新的视角。主要研究结果如下：

（1）草鱼GRP78的基因克隆及重组蛋白的制备

通过基因克隆获得草鱼GRP78的开放阅读框（Openreadingframe，ORF）序列，共

1962bp，编码653个氨基酸，一个信号肽，无跨膜结构域，相对分子质量为75ku，等

电点为5.01，含有47个磷酸化位点。系统发育树显示，草鱼GRP78与青鱼

（Mylopharyngodonpiceus）同源性最高。组织分布结果表明，草鱼GRP78在眼、脑、

鳃、头肾和肾脏等组织中高表达。本实验以pET-32a为表达载体，通过蛋白质原核表达

技术获得浓度和纯度较高的重组GRP78蛋白。

（2）GRP78在脂肪肝细胞源外泌体中被富集

油酸（Oleicacid，OA）孵育草鱼原代肝细胞24h后发现，肝细胞中甘油三酯

（Triglycerides，TG）含量显著升高（P0.05），脂滴增多。RT-qPCR结果表明，与对

照组相比，OA孵育肝细胞24h显著升高了脂质合成相关因子SREBP-1和PPARγ的表

达，降低了脂质分解关键基因ATGL的表达（P0.05），诱导脂肪肝细胞形成。WB和

免疫荧光结果显示，脂肪肝细胞和脂肪肝细胞源外泌体中的GRP78蛋白的表达均显著

上调（P0.05）。内质网应激相关基因GRP78、PERK、IRE1α、ATF6和XBP1s的表达

也显著升高（P0.05）。以上结果表明，脂肪肝细胞中内质网的应激增强，且GRP78在

脂肪肝细胞源外泌体中被显著富集。

（3）脂肪肝细胞源外泌体通过GRP78调节草鱼肝细胞脂质代谢

为探究脂肪肝细胞源外泌体和GRP78对肝细胞脂质代谢的影响，将OA-Exo（50

μg/mL）和GRP78蛋白（1μg/mL）分别孵育肝细胞24h，结果显示，与对照组相比，

OA-Exo组和GRP78组肝细胞中的TG和胆固醇（Totalcholesterol，TC）含量均显著升

高（P0.05），脂滴增多，GRP78和IRE1α蛋白的表达显著上调（P0.05）。结果表明，

OA-Exo和GRP78促进肝细胞的脂质蓄积，IRE1α可能是其发挥功能的重要路径。

为验证上述推测，本实验进一步用4μ8C（IRE1α通路的抑制剂）抑制IRE1α通路，

再用OA-Exo和GRP78孵育肝细胞24h。结果显示，与对照组相比，4μ8C组TG含量

显著降低（P0.05）。与4μ8C组相比，OA-Exo和GRP78逆转了4μ8C的作用，升高

了细胞中的TG、TC和脂滴的含量，IRE1α蛋白的表达也显著上调（P0.05）。以上结

果提示，OA-Exo和GRP78激活IRE1α通路促进肝细胞的脂质蓄积，且脂肪肝细胞源外

泌体可能通过其富集的GRP78来发挥作用。

为探究脂肪肝细胞源外泌体是