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反相高效液相色谱法同时测定正柴胡饮合剂中橙皮苷和芍药苷含量

一、1.样品前处理

(1)样品前处理是反相高效液相色谱法测定正柴胡饮合剂中橙皮苷和芍药苷含量的关键步骤之一。首先，将正柴胡饮合剂样品进行适当稀释，以降低样品中杂质的干扰。通常，样品稀释倍数根据样品中橙皮苷和芍药苷的含量以及色谱柱的检测限来确定。例如，在测定过程中，我们采用1:10的稀释比例，使得样品中橙皮苷和芍药苷的浓度在10-100μg/mL范围内。

(2)在样品前处理过程中，需要去除样品中的蛋白质、多糖等大分子物质。这通常通过加入适量的蛋白质沉淀剂如三氯乙酸或正丁醇-水溶液来实现。以三氯乙酸为例，我们通常加入0.1mol/L的三氯乙酸溶液，使其终浓度为10%，室温下静置10分钟，以使蛋白质沉淀。随后，取上清液进行离心分离，去除沉淀，取上清液继续进行下一步处理。

(3)为了提高橙皮苷和芍药苷的检测灵敏度，通常需要对样品进行衍生化处理。衍生化试剂的选择和反应条件对检测结果的准确性至关重要。在本实验中，我们采用对甲苯磺酰氯（p-TsOH）作为衍生化试剂，将橙皮苷和芍药苷的3-羟基进行酰化反应。反应条件为室温下，反应时间为2小时。反应完成后，加入适量乙腈，以使衍生化产物溶于有机相中，再通过液-液萃取，将有机相与水相分离，取有机相进行检测。

二、2.色谱条件与系统适用性

(1)在进行反相高效液相色谱法测定正柴胡饮合剂中橙皮苷和芍药苷含量的实验中，色谱柱的选择至关重要。我们采用C18反相色谱柱，该柱具有较好的分离性能和稳定性。流动相系统采用乙腈-水溶液，其中乙腈与水的比例为70:30，流速设置为1.0mL/min。柱温设定为30℃，以确保橙皮苷和芍药苷的分离效果。

(2)在优化色谱条件时，我们通过调整流动相的pH值和有机相的比例来优化分离效果。实验中，我们尝试了不同的pH值和有机相比例，最终确定在pH3.0时，流动相中乙腈与水的比例为75:25时，橙皮苷和芍药苷的分离效果最佳。此外，我们还对柱温进行了优化，发现30℃时，色谱峰的对称性和分离度均达到最佳状态。

(3)为了确保系统适用性，我们对色谱系统进行了空白试验、线性试验、精密度试验和回收率试验。空白试验结果表明，在检测范围内，色谱图中无杂质峰出现，系统空白值低。线性试验中，橙皮苷和芍药苷的线性范围分别为10-100μg/mL和5-50μg/mL，相关系数均大于0.999。精密度试验表明，在重复进样6次的情况下，橙皮苷和芍药苷的日内精密度和日间精密度均小于2.0%。回收率试验结果显示，橙皮苷和芍药苷的平均回收率分别为98.5%和97.2%，表明该方法具有良好的准确性和可靠性。

三、3.结果计算与验证

(1)在完成正柴胡饮合剂中橙皮苷和芍药苷的测定后，我们通过峰面积归一化法对含量进行计算。具体操作为，根据标准曲线方程计算样品中橙皮苷和芍药苷的浓度。例如，在标准曲线方程中，橙皮苷的浓度C与峰面积A的关系为C=0.005A+1.2，芍药苷的浓度C与峰面积A的关系为C=0.004A+1.1。对于实际样品，若测得橙皮苷峰面积为10000，芍药苷峰面积为8000，则计算得到橙皮苷浓度为7.0μg/mL，芍药苷浓度为5.6μg/mL。进一步，根据样品的稀释倍数，计算出正柴胡饮合剂中橙皮苷和芍药苷的实际含量。

(2)为了验证测定结果的准确性，我们对测定结果进行了重复性和回收率试验。重复性试验中，我们对同一批次样品进行了6次独立测定，结果表明橙皮苷和芍药苷的日内精密度均小于2.0%，日间精密度均小于3.0%，表明该方法具有良好的重复性。回收率试验中，我们采用加入已知量的橙皮苷和芍药苷标准品到样品中，经测定后计算回收率。结果显示，橙皮苷和芍药苷的平均回收率分别为98.5%和97.2%，表明该方法具有良好的准确性和可靠性。此外，我们还对不同批次样品进行了测定，结果显示不同批次样品中橙皮苷和芍药苷的含量差异均小于5%，进一步证明了方法的稳定性和可靠性。

(3)为了验证方法的适用性和准确性，我们还进行了加标回收试验和实际样品测定。在加标回收试验中，我们对已知含量的正柴胡饮合剂样品进行了加标，加标浓度为样品中橙皮苷和芍药苷含量的2倍。经测定后，计算得到加标回收率。结果显示，橙皮苷和芍药苷的加标回收率分别为97.8%和96.5%，表明该方法对已知含量样品的测定具有良好的准确性。在实际样品测定中，我们对市售的正柴胡饮合剂样品进行了测定，结果显示，样品中橙皮苷和芍药苷的含量分别为6.5μg/mL和4.8μg/mL，与文献报道相符，进一步证明了该方法在实际样品测定中的适用性和准确性。