高效液相色谱法测定牛奶中黄曲霉毒素酝1含量的不确定度评定.docxVIP

PAGE

1-

高效液相色谱法测定牛奶中黄曲霉毒素酝1含量的不确定度评定

一、1.测定方法概述

(1)高效液相色谱法（HPLC）是一种广泛应用于食品、药品和环境样品中微量污染物检测的分析技术。在牛奶中黄曲霉毒素B1（AFB1）含量的测定中，HPLC因其高灵敏度、高准确度和高选择性而成为首选方法。AFB1是一种强致癌物，主要来源于受黄曲霉菌污染的粮食和饲料，因此对牛奶中AFB1的检测尤为重要。该方法通常包括样品前处理、色谱分离和检测三个主要步骤。

(2)样品前处理是HPLC测定AFB1的关键环节，它直接影响到检测结果的准确性和灵敏度。常用的前处理方法包括液-液萃取、固相萃取和基质匹配萃取等。例如，液-液萃取法中，常用的有机溶剂有乙腈、正己烷和丙酮等，通过将样品与有机溶剂混合，使AFB1从牛奶基质中萃取出来。固相萃取则利用固相吸附剂的选择性吸附作用，将AFB1从复杂样品中分离出来。在实际操作中，前处理条件如萃取溶剂、萃取时间、pH值等都会对AFB1的回收率产生影响。

(3)色谱分离是HPLC测定的核心步骤，通过高效液相色谱仪对样品进行分离，将AFB1与其他物质分离开来。常用的色谱柱为C18柱，流动相通常为乙腈-水溶液，其中加入一定比例的醋酸或磷酸调节pH值。检测器方面，常用的有荧光检测器（FLD）和二极管阵列检测器（DAD）。以FLD为例，AFB1在特定波长下发出荧光，通过检测荧光强度可以定量分析AFB1的含量。在实际应用中，为了提高检测灵敏度，常采用衍生化技术，将AFB1转化为荧光响应更强的衍生物。例如，AFB1与2,4-二硝基苯肼反应生成2,4-二硝基苯腙，该衍生物在FLD下具有更高的荧光强度，从而提高检测灵敏度。

二、2.不确定度来源分析

(1)在高效液相色谱法测定牛奶中黄曲霉毒素B1含量的不确定度评定中，不确定度来源广泛，主要包括方法不确定度、样品不确定度、仪器不确定度和操作者不确定度。方法不确定度主要来源于标准曲线的斜率、线性范围和交叉污染等。样品不确定度可能源于样品前处理过程中的萃取效率、回收率以及样品基质效应等。仪器不确定度则涉及色谱仪、检测器等仪器的校准精度和稳定性。操作者不确定度可能与操作者的技术水平、样品处理的一致性以及数据分析的准确性有关。

(2)具体到HPLC测定牛奶中AFB1含量的不确定度来源，标准曲线的不确定度是其中一个重要因素。标准曲线的斜率和截距的不确定性会影响定量结果的准确性。此外，样品前处理过程中的不确定度也不容忽视，如萃取过程中溶剂的选择、萃取时间和pH值等参数的不确定性都可能对最终结果产生影响。同时，仪器的不确定度，如色谱柱的柱效、检测器的灵敏度等，也会对AFB1的定量结果造成影响。

(3)操作者的不确定度也是不可忽视的一部分。在样品前处理过程中，操作者的技术水平、操作步骤的一致性以及对待样品的细心程度都会对最终结果产生影响。例如，在固相萃取过程中，如果操作者对吸附剂的使用不当，可能会导致AFB1的回收率不准确。在数据分析阶段，操作者对数据处理软件的使用不当或者对数据处理方法的误用也可能引入不确定度。因此，对操作者进行规范化的培训和使用标准化的操作程序是减少操作者不确定度的有效途径。

三、3.测量不确定度计算

(1)测量不确定度的计算通常遵循国际通用标准ISO/IEC17025和ISO/IEC17043。首先，需要对每个不确定度来源的分量进行评估和计算。这些分量可以是随机效应和系统效应的方差和标准差。例如，对于标准曲线的不确定度分量，可以分别计算标准曲线斜率和截距的不确定性，然后将它们合成得到标准曲线的不确定度。

(2)在计算过程中，需要考虑所有相关的输入量及其不确定度。例如，对于样品前处理过程中的不确定度，需要评估萃取效率、回收率和基质效应等参数的不确定度。这些参数的不确定度可以通过实验室间的比对实验、重复实验或者查阅文献获得。每个参数的不确定度都要乘以其在测量结果中的相对贡献，从而得到其对最终不确定度的贡献。

(3)计算完成后，需要将这些分量的不确定度分量合并为合成不确定度。合并的方法有多种，如方和根法（根和平方和）或最大误差法等。合成不确定度代表了测量结果的分散程度，通常以标准不确定度表示。最后，还需要将合成不确定度转换为扩展不确定度，以确定测量结果的置信区间。扩展不确定度通常以覆盖因子k（如k=2）与标准不确定度的乘积来表示。

四、4.结果不确定度评定

(1)在进行结果不确定度评定时，首先需要对实验数据进行统计分析。以HPLC测定牛奶中AFB1含量为例，我们可以收集一系列标准品和实际样品的测量值，然后计算平均值、标准差和变异系数（CV）。假设我们进行了10次独立测量，得到了AFB1含量的平均值为10ng/mL，标准差为1.5ng/mL，那么变异系数CV为