植物基因工程 (2).ppt

?-葡萄糖苷酸酶基因（gus）gus基因编码?-葡萄糖苷酸酶,存在于某些细菌体内，该酶是一种水解酶，能催化许多?-葡萄糖苷酸类物质的水解。绝大多数的植物细胞内不存在内源的GUS活性，许多细菌及真菌也缺乏内源GUS活性，因而gus基因被广泛应用作转基因植物、细菌和真菌的报告基因，尤其是在研究外源基因瞬时表达的转化实验中，gus基因应用最多。其最大优势是易于用组化法观测其原位表达，是最常用的监测转染效率的报道基因之一。第38页,共53页，星期六，2024年，5月氯霉素乙酰转移酶基因该基因来自大肠杆菌转座子Tn9，它能够催化乙酰基团从乙酰辅酶A转移到氯霉素分子上，导致氯霉素分子发生乙酰化作用，从而使其失去活性。真核细胞中部含有氯霉素乙酰转移酶基因，无该酶的内源活性，因而该基因可作为真核细胞转化的选择基因及报告基因。第39页,共53页，星期六，2024年，5月CAT在哺乳细胞无内源性表达，性质稳定，半衰期相对较短，适于检测其瞬时表达。可用同位素标记法、荧光法和自动ELISA法检测其活性，也可进行Westernblots和免疫组织化学分析。CAT与其它报道基因相比，线性范围较窄，灵敏性较低。第40页,共53页，星期六，2024年，5月荧光素酶

????荧光素酶是能够催化不同底物(荧光素、CO—elenterazine)氧化发光的一类酶，哺乳细胞无内源性荧光素酶。最常用的荧光素酶有细菌荧光素酶、萤火虫荧光素酶和ReniHa荧光素酶（海洋腔肠Luc）。细菌荧光素酶对热敏感，因此其在哺乳细胞的应用受到限制。萤火虫荧光素酶灵敏度高，检测线性范围宽达7-8个数量级，是最常用于哺乳细胞的报道基因。用荧光比色计即可检测酶活性，因而适于高通量筛选。随着具有膜通透性和光裂解作用的萤火虫荧光素酶的应用，无需裂解细胞即可检测酶活性；ReniHa荧光素酶催化CO—elenterazine氧化，产物可透过生物膜，可能是最适用于活细胞的报道分子。第41页,共53页，星期六，2024年，5月荧光素酶基因该基因有很多种，它可以催化荧光素发出荧光。荧光素是荧光素酶催化的底物合成，不同荧光素的化学结构有一定差异甚至完全不同。荧光素酶基因的活性检测非常简单，直接将被检的材料进入加有荧光素和ATP的缓冲液中，置于暗室用肉眼直接观察荧光，或覆盖X-光胶片曝光，也也用荧光光度计定量检测.第42页,共53页，星期六，2024年，5月荧光蛋白家族

????荧光蛋白家族是从水螅纲和珊瑚类动物中发现的分子量为20～30kD的同源性蛋白。绿色荧光蛋白(GFP)是应用最多的发光蛋白。GFP存在于发光水母(AequoreaVictoria)。用395nm的UV和475nm的蓝光激发，GFP可在508nm处自行发射绿色荧光，无需辅助因子和底物。GFP最大的优势是无需损伤细胞即可研究细胞内事件。1991年克隆了GFP基因，目前已获得几个突变体。如“红色迁移”突变体(“red—shift”mutant)，其荧光更强。其突变体还有蓝色荧光蛋白(BFP)、增强型GFP(enhancedGFP)和去稳定EGFP(destabilizedEGFP)等。红色荧光蛋白(RFP)是从珊瑚(D~cosomasp．)中分离的发光蛋白(drFP583或DsRed)可发射明亮的红色荧光。

???第43页,共53页，星期六，2024年，5月?这些常用的报道基因也可被联合应用，可同时检测2个甚至3个基因的表达。报道基因的选择依赖于其灵敏性、可靠性及监测的动力学范围。稳定性好的报道基因适于基因转录动力学研究和高通量筛选，尤其适用于基因转移的定性研究。第44页,共53页，星期六，2024年，5月报道基因随着技术和检测方法的进步，荧光分析以其能够将细胞内报告基因的活性可视化和对细胞的非破坏性而越来越成为主流，因此荧光素酶和绿色荧光蛋白这两种可发出荧光的报告基因成为众多报告基因中的后起之秀.第45页,共53页，星期六，2024年，5月绿色荧光蛋白(GFP)?1992年，Prasher和Chaltqe报道了几种生物发光水母的发光是由于能量转移至GFP所致，该蛋白在接受了Ca2+激活的光蛋白水母素的能量后可在体内产生荧光，这一过程不需要底物或辅助因子。GFP是一条由238个氨基酸组成的多肽链，纯化的GFP与体内表达的该蛋白有相似的发光谱，无论在原核或真核细胞中表达，当用蓝光或紫外光激发下，都能产生一种很亮的绿色荧光。鉴于上述特性以及所具有的低毒性、不干扰正常的细胞活动等优点，从此开辟了GFP在生物领域中(尤其是体内分析)的广泛应用，目前已应用于启动子分析、转基因领域、基因表达的蛋白质定位、细胞定位以及