实验动物 病原菌PCR定性分析.docxVIP

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DB44/XXXXX—2021

实验动物病原菌PCR定性分析

1范围

本文件规定了实验动物病原菌的PCR定性分析方法。本文件适用于实验动物病原菌核酸定性分析。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14926实验动物微生物检测方法

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求

3术语和定义

下列术语和定义适合于本文件。3.1

聚合酶链式反应polymerasechainreaction，PCR

体外酶催化合成特异DNA片段的方法，模板DNA先经高温变性成为单链，在DNA聚合酶作用和适宜的反应条件下，根据模板序列设计的两条引物分别与模板DNA两条链上相应的一段互补序列发生退火而相互结合，接着在DNA聚合酶的作用下以四种dNTP为底物，使引物得以延伸，然后不断重复变性、退火和延伸这一循环，使欲扩增的基因片段以几何倍数扩增。

3.2

实时荧光聚合酶链式反应real-timePCR，实时荧光PCR

实时荧光PCR方法是在普通PCR的基础上，在反应体系中加入特异性荧光探针，利用荧光信号积累实时报告整个PCR进程，通过读取每次循环反应中的荧光发射信号，间接反映了PCR扩增的目标基因的量，最后通过扩增曲线对未知模板进行定性或定量分析。

3.3

Ct值cyclethreshold

实时荧光PCR反应中每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。

4缩略语

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下列缩略语适用于本文件。

DNA脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）

EDTA乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid）

PBS磷酸盐缓冲液（phosphatebufferedsaline）

RNA核糖核酸（ribonucleicacid）

TAE三羟甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸缓冲液（tris-acetate-EDTA）

5原理

用合适的方法提取样本中的DNA，分别针对病原菌16sRNA或其他保守的基因设计特异的引物探针序列，通过PCR对模板进行扩增，根据PCR反应结果分析该样品中是否含有某种病原菌。

6主要设备和材料

6.1PCR仪。

6.2实时荧光PCR仪。

6.3电泳仪。

6.4凝胶成像分析系统。

6.5高速冷冻离心机。

6.6普通离心机。

6.7恒温孵育器。

6.8漩涡振荡器。

6.9组织匀浆器。

6.10微量核酸定量仪。

6.11生物安全柜。

6.12PCR超净工作台。

6.13冰箱（-20℃)。

6.14微量移液器：0.1μL～2μL，1μL～10μL，10μL～100μL，100μL～1000μL。

6.15灭菌离心管（1.5mL、2mL、5mL、15mL），灭菌吸头（10μL，200μL，1mL），灭菌PCR

扩增反应管（0.2mL，八连管或96孔板）。

6.16聚乙烯薄膜袋：90mm×150mm自封袋，使用前紫外灭菌20min。

6.17采样工具：剪刀、镊子和灭菌棉拭子等。

7试剂

7.1以下所用的试剂除特别注明者外均为分析纯，所用的水为双蒸水或去离子水，应符合GB/T6682

所规定一级水的要求。所有涉及分子生物学操作的水均为无DNA酶、无RNA酶水。

7.2灭菌PBS。配制方法见附录A。

7.3DNA抽提试剂：基因组DNA提取试剂盒DNeasyBloodTissueKit或其他类似产品。

注：DNA提取试剂盒是由Qiagen公司提供的DNeasyBloodTissueKit。给出这一信息是为了方便本文件使用者，并不表示对这一产品的认可。亦可使用其他类似的DNA提取试剂盒进行。

7.4无水乙醇。

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7.5PCR试剂：PremixTaqTM（Version2.0plusdye）、PremixExTaq?（ProbeqPCR）或其他类

似产品。

注：以上PCR试剂是是由Takara公司提供的商品试剂盒，是本文件适