医用分子遗传学真核生物复制.ppt

互补DNA（complementaryDNA,cDNA）用于合成cDNA.建立cDNA文库(cDNALibrary)，获得基因或探针。

与PCR连用RT-PCR第四节DNA复制的调控DNA复制是细胞增殖的一个关键事件，因此，DNA复制与细胞分裂是互相协调、互相调控的。无论原核还是真核细胞中DNA复制都只发生在细胞周期中特定时期，在一个细胞周期中，DNA必须也只能复制一次。一大肠杆菌复制的调节起始体（orisome，起始复合物，蛋白质-oriC复合物）的装配01参与形成orisome的组分：02DnaA,Hu,IHF，Fis，Dpi，IciA，Cnu，Hha，Rob，SeqA，ArcA03相互作用：Fis,IHF调节DnaA-ATP与oriC的结合，HU调节DnaA,IHF结合到oriC,并增强DnaA解链能力。04防止复制再次起始DnaA活性的抑制DnaA-ADPDnaA-ATP无活性RIDA有活性RIDA：regulatoryinactivationofDnaA12oriC降低游离形式的DnaA水平DnaA结合位点datA区在复制后极短时间内降低DnaA水平可以结合300分子的DnaAoriCGATCCTAG甲基化未甲基化摸板链新合成链二真核生物复制起始调控主要调控复制的起始DNA复制起始的调控细胞周期监控点机制(一)、DNA复制起始的调节复制起始点数量的调控1S期短，起始点多。S期长，起始点少。3功能性起始点：实际起始点5真核细胞有多个复制起始点，起用多少起始点决定于S期的长短。2遗传性起始点：DNA上的起始元件4遗传性起始点多于功能性起始点6复制起始点的选择酵母：自主复制序列（autonomouslyreplicatingsequeences,ARS)酵母细胞3号染色体上有14个遗传性复制起始点，只有6个功能性复制起始点。将Ura4基因处的强复制起始点突变后，在其附近的弱复制起始点就成为强复制起始点。Ura4：乳清苷酸脱羧酶高等真核生物细胞至今未发现遗传性复制起始点的序列特征，但确实存在功能性的复制起始点。CHO细胞核蟾蜍卵细胞抽提物损坏CHO细胞核或裸露DNA非随机起始，同正常随机起始CHO细胞复制起始点的选择与细胞核或染色体结构密切相关2、复制起始调控机制复制的允许机制（Licensingmodel）01.蛋白激酶的调控02.01复制的允许机制（Licensingmodel）一个细胞周期中DNA复制发生一次且只能发生一次02蟾蜍卵细胞0304Licensingcontrol复制外源细胞核05复制后，LicensingFactor失活，失活的LicensingFactor不能再次启动复制。核膜破裂后（细胞分裂后），新的LicensingFactor进入核，启动下一周期的DNA复制。（2）蛋白激酶的调控真核细胞复制起始绝对必须的蛋白激酶：CDK和Cdc7-Dbf4激酶(1)、前复制起始复合物的形成组成成分：ORC(OriginRecognitionComplex)含6种蛋白质，Cdc6，RLF（ReplicationLicensingFactor,复制允许因子）。(2)、CDK激活前复制起始复合物复制前复合物受蛋白激酶的调控，或变成起始复合物，起始复制，或在复制过程中转变成复制后复合物，就再也不能启动复制。CDK（CyclinDependent),Cdc7-Dbf4激酶，蛋白激酶A，蛋白磷酸酶2A，都参与复制的起始，在不同阶段起作用。前复制起始复合物（pre-replicativecomplex，pre-RC)（在遗传性复制起始点装配）CDK起始复合物（ReplicativeComplex,RC)（在功能性复制起始点形成）在G1期向S期过渡期间，CDK活性很高。CDK同时又是防止在同一细胞周期中DNA复制再次发生的因素,阻止复制起始复合物的组装。CDK对某些起始因子磷酸化,调控其在细胞内水平。（二）复制检