植物外源基因转化方法及转化子的检测.ppt

第37页,共56页，星期六，2024年，5月便携式基因枪第38页,共56页，星期六，2024年，5月基因枪法转化的优点有：无宿主限制：农杆菌介导法只对双子叶植物敏感，限制了它的应用范围。而基因枪没有物种限制。靶受体类型广泛：可以是原生质体，叶片，悬浮细胞，茎或根切段，种子胚，愈伤组织，花粉等。操作简单快速但该方法转化率低，外源DNA整合机理不清楚。且形成多拷贝第39页,共56页，星期六，2024年，5月3.4花粉管通道法花粉管通道法是将外源的DNA片段在自花授粉后的特定时期注入柱头或花柱，使外源DNA沿花粉管通道进入胚囊，转化受精卵或其前后细胞。这一技术可以应用于任何开花植物。该方法是有我国科学家周光宇等（1983）建立并在长期科学研究中发展起来的。第40页,共56页，星期六，2024年，5月微注射法：一般适合于较大花的农作物如棉花等。利用微量注射器将基因溶液注射进入受精子房柱头滴加：在授粉前后，将转基因溶液滴加在柱头上花粉粒携带：即用基因溶液处理花粉粒，让花粉粒吸入基因，然后授粉。第41页,共56页，星期六，2024年，5月优点：利用整体植株的卵细胞、受精卵或早期胚细胞转化DNA，无需细胞、原生质体等组织培养和诱导再生植株等一套人工培养过程。方法简便；单、双子叶植物均可应用；育种时间短。这一技术局限欲开花时间才能应用；对DNA大小纯度要求高。机理？第42页,共56页，星期六，2024年，5月常用植物基因转化方法特点比较转化方法农杆菌法PEG法电击法微针注射法基因枪法花粉管通道法受体材料完整细胞原生质体原生质体原生质体完整细胞卵细胞宿主范围有无无无无有性繁殖植物组培条件简单复杂复杂复杂简单无嵌合体比例有无无无多无操作复杂性简单简单复杂复杂复杂简单设备要求便宜便宜昂贵昂贵昂贵便宜工作效率高低低低高低单子叶植物应用少可行可行可行广泛广泛第43页,共56页，星期六，2024年，5月4.植物基因转化系统的选择原则对农杆菌敏感的植物应首先试用农杆菌载体转化系统，因为农杆菌转化是在理论和技术操作上都比较成熟的转化系统，而且转化效率高，转化植株的遗传稳定性最好。原生质体培养容易的植物应该选择直接转化系统，因为其优点是既能获得高的转化率，又能克服转基因植株嵌合体的难题。多胚珠植物可试用花粉管通道法，因为涂抹在柱头上的外源DNA可以随着许多花粉管进入子房，分别导入各卵细胞中，提高转化率。子房中有较大单胚珠的植物如核果类植物，宜试用显微注射法，因为将外源DNA直接注入卵细胞的可能性较大。转化难度大的植物，即对农杆菌转化不敏感，原生质体培养困难的植物，应采用基因枪法。根据供试外植体的特点选择相应的转化方法，如以整体植株为试材，则应采用注射法和花粉管通道法；以叶片为外植体，则应用农杆菌载体叶盘法或基因枪法。第44页,共56页，星期六，2024年，5月5.转基因植物的检测鉴定进行基因转化后，外源基因是否进入植物细胞，进入植物细胞的外源基因是否整合到植物染色体上，整合的方式如何，整合到染色体上的外源基因是否表达，这一系列问题仍需回答。只有获得充分的证据后才可以认为被检材料是转基因的。第45页,共56页，星期六，2024年，5月5.1转基因植物的检测鉴定方法报告基因的表达检测转基因植物的PCR检测外源基因整合的Southern杂交鉴定外源基因转录的Northern杂交检测外源基因表达蛋白的检测生物学鉴定第46页,共56页，星期六，2024年，5月5.2报告基因的表达检测报告基因是明显区别于受体细胞遗传背景的选择标记，又称选择标记基因。常用的报告基因NPT-II新霉素磷酸转移酶基因抗氨基环醇类抗生素CAT氯霉素乙酰转移酶基因抗氯霉素HPT潮霉素磷酸转移酶基因抗潮霉素GUS?-葡萄糖苷酸酶基因产生蓝色物质GFP绿色荧光蛋白基因产生绿色荧光LUC荧光酶素基因发射光子第47页,共56页，星期六，2024年，5月npt-Ⅱ活性检测目的：检测Npt-Ⅱ基因在植物组织中的表达原理：Npt-Ⅱ使ATP分子上的?-P转移到抗生素分子上，影响抗生素与核糖体的结合，从而使抗生素失活。检测时使用放射性标记的[?-32P]ATP，通过?