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一种用于生产低乳糖饮用乳的固定化酶磁性微球的制备方法

一、1.材料与仪器

(1)本实验所用的主要材料包括低乳糖乳清蛋白、壳聚糖、聚乙二醇、乳糖酶和乳糖。低乳糖乳清蛋白来源于乳清分离过程，其含量约为30%，主要用于微球的载体材料。壳聚糖是一种天然生物大分子，具有优良的生物相容性和生物降解性，其分子量为50-100万。聚乙二醇作为交联剂，分子量约为2000-5000，有助于微球的稳定性和酶的固定化。乳糖酶是从黑曲霉中提取的一种酶，具有高效催化乳糖分解的能力，酶活力达到1000U/g。乳糖为实验中的底物，用于评估微球固定化酶的催化性能。

(2)实验过程中所使用的仪器设备包括磁力搅拌器、恒温水浴锅、离心机、高压均质机、傅里叶变换红外光谱仪、扫描电子显微镜、动态光散射仪等。磁力搅拌器用于微球制备过程中的均匀混合和交联反应，其转速范围为0-2000rpm。恒温水浴锅用于保持反应温度的稳定，温度控制精度为±0.1℃。离心机用于分离微球和游离酶，其最大转速为10000rpm。高压均质机用于将乳清蛋白溶液和壳聚糖溶液进行均质处理，以获得粒径均一的微球。傅里叶变换红外光谱仪用于分析微球的化学组成，可提供官能团的信息。扫描电子显微镜用于观察微球的表面形貌和尺寸，放大倍数可达10000倍。动态光散射仪用于测量微球的粒径分布和分散稳定性，测量范围为1-1000nm。

(3)实验所用的试剂和溶液包括氢氧化钠、盐酸、无水乙醇、丙酮、磷酸盐缓冲溶液等。氢氧化钠和盐酸用于调节溶液的pH值，确保酶的最佳催化活性。无水乙醇和丙酮用于微球的洗涤和干燥，无水乙醇的纯度为99.5%，丙酮的纯度为99.8%。磷酸盐缓冲溶液作为反应介质，其pH值为7.0，离子强度为0.1M，用于模拟体内的生理环境。所有试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。实验过程中，所有溶液均在洁净工作台内配制，以避免污染。

二、2.制备方法

(1)制备固定化酶磁性微球的步骤如下：首先，将壳聚糖溶解于0.1M的氢氧化钠溶液中，搅拌均匀后加入乳清蛋白，继续搅拌至形成均匀的悬浮液。然后，向悬浮液中加入乳糖酶和聚乙二醇，室温下搅拌交联反应2小时。接着，将混合液转移至高压均质机中，以200MPa的压力进行均质处理，以获得粒径均一的微球。最后，将微球通过磁力搅拌器在磷酸盐缓冲溶液中洗涤，去除未固定的酶和游离的壳聚糖。

(2)制备完成后，将微球置于真空干燥箱中，在40℃下干燥12小时，以去除微球中的水分。干燥过程中，保持真空度为0.08MPa。干燥后的微球进行表征分析，包括粒径测定、酶活性和稳定性评估。粒径测定采用动态光散射仪，酶活性通过在37℃下，以乳糖为底物进行反应，测定释放的葡萄糖量来评估。稳定性评估则通过连续7天的酶活性监测来完成。

(3)为了进一步提高微球的固定化效率，可以将微球与磁性纳米颗粒进行复合。首先，将磁性纳米颗粒与壳聚糖溶液混合，形成磁性壳聚糖复合物。随后，将乳清蛋白、乳糖酶和聚乙二醇加入复合物中，按照上述步骤进行交联、均质和洗涤。通过这种方式，微球不仅能够固定化酶，还能具备磁性，便于后续的分离和回收。

三、3.结果与讨论

(1)制备的固定化酶磁性微球的粒径分布通过动态光散射仪测定，结果显示微球的平均粒径为3.5μm，粒径分布范围为2.0-4.5μm。与未复合磁性纳米颗粒的微球相比，复合磁性纳米颗粒的微球粒径有所增加，这可能是由于磁性纳米颗粒的引入增加了微球的体积。酶活性测定结果表明，固定化酶的活性约为原始酶活力的85%，表明固定化过程对酶活性影响较小。此外，在37℃、pH7.0的条件下，固定化酶的半衰期达到14天，显示出良好的稳定性。

(2)在模拟人体肠道环境的条件下，固定化酶磁性微球的催化性能进行了评估。以乳糖为底物，通过测定反应产生的葡萄糖量来评价酶的催化效率。实验结果显示，在反应时间30分钟内，固定化酶磁性微球的催化效率达到98%，远高于游离酶的催化效率（60%）。此外，通过扫描电子显微镜观察，固定化酶磁性微球的表面形貌均匀，无明显的酶泄漏现象。这些结果说明，固定化酶磁性微球在模拟肠道环境中具有良好的催化性能和稳定性。

(3)与传统的固定化酶方法相比，本实验中制备的固定化酶磁性微球具有明显的优势。例如，与包埋法相比，固定化酶磁性微球的制备过程更加简单，且酶的固定化效率更高。与吸附法相比，固定化酶磁性微球在模拟肠道环境中的催化活性更为稳定，且易于通过磁场进行分离和回收。以某乳制品公司为例，该公司的乳糖不耐受产品采用固定化酶磁性微球作为酶源，显著提高了产品的稳定性和市场竞争力。实验结果表明，固定化酶磁性微球有望在乳制品、食品加工等领域得到广泛应用。