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利用毕赤酵母分泌表达精氨酸脱亚胺酶及构建方法[发明专利]

一、背景技术

(1)精氨酸脱亚胺酶（ArginineDeiminase，AD）是一种重要的生物催化酶，在氨基酸代谢、生物合成以及疾病治疗等领域具有广泛的应用前景。传统上，AD的提取和纯化过程复杂，且产量较低，限制了其在工业和科研领域的应用。因此，开发高效、稳定的AD表达系统，对于推动相关领域的科技进步具有重要意义。

(2)毕赤酵母（Pichiapastoris）作为一种常见的表达宿主，具有表达水平高、生长速度快、易于操作等优点，已被广泛应用于蛋白质工程和生物制药领域。近年来，通过基因工程改造毕赤酵母，使其能够高效分泌表达外源蛋白，成为研究热点。利用毕赤酵母分泌表达AD，有望提高AD的产量和活性，降低生产成本，为AD在生物技术领域的应用提供有力支持。

(3)目前，关于AD的分泌表达研究主要集中在基因工程改造、表达系统优化等方面。通过对毕赤酵母的基因进行修饰，可以增强其分泌表达能力，提高AD的产量。此外，通过优化发酵条件、培养基配方等，可以进一步提高AD的表达水平。然而，目前关于毕赤酵母分泌表达AD的专利技术仍较为有限，有必要进一步研究和开发。

二、毕赤酵母分泌表达精氨酸脱亚胺酶的方法

(1)本发明提供了一种利用毕赤酵母分泌表达精氨酸脱亚胺酶的方法，该方法包括以下步骤：首先，通过基因工程技术，将精氨酸脱亚胺酶的编码基因克隆到毕赤酵母表达载体中；然后，将构建好的表达载体转化至毕赤酵母细胞中，筛选出分泌表达精氨酸脱亚胺酶的重组菌株；接着，优化发酵条件，包括温度、pH值、营养物质等，以提高精氨酸脱亚胺酶的表达量和活性；最后，通过离心、透析等手段从发酵液中提取精氨酸脱亚胺酶，并通过活性检测和纯化工艺获得高纯度的精氨酸脱亚胺酶。

(2)在该方法中，选择合适的毕赤酵母菌株是关键步骤之一。通过比较不同毕赤酵母菌株的分泌表达能力，本发明采用了一种具有较高分泌表达能力的毕赤酵母菌株作为宿主。此外，通过基因工程手段，将精氨酸脱亚胺酶编码基因进行优化，包括密码子优化、启动子选择等，以提高其在毕赤酵母中的表达水平。通过这些优化措施，可以显著提高精氨酸脱亚胺酶的表达量，从而提高整个表达系统的效率。

(3)为了进一步优化精氨酸脱亚胺酶的表达条件，本发明对发酵过程进行了深入的研究。通过实验，确定了最佳的温度、pH值、营养物质添加量等发酵条件，这些条件有助于提高精氨酸脱亚胺酶的分泌表达量。此外，通过优化发酵工艺，如增加发酵时间、调整通气量等，可以进一步提高精氨酸脱亚胺酶的产量。通过这些优化措施，本发明提供了一种高效、稳定的毕赤酵母分泌表达精氨酸脱亚胺酶的方法，具有广泛的应用前景。

三、构建方法及实验步骤

(1)构建毕赤酵母分泌表达精氨酸脱亚胺酶的方法首先涉及基因克隆的步骤。首先，设计并合成精氨酸脱亚胺酶基因的上下游序列，包括启动子、终止子和必要的标签序列。然后，通过PCR技术扩增精氨酸脱亚胺酶基因，并使用限制性内切酶对扩增产物和表达载体进行酶切，以连接构建表达载体。具体操作包括：设计引物，优化PCR反应条件，进行PCR扩增；使用DNA回收试剂盒纯化PCR产物；利用限制性内切酶对表达载体和PCR产物进行酶切；通过DNA连接酶将酶切后的基因片段与表达载体连接；最后，通过转化实验将构建好的表达载体转化入毕赤酵母细胞中。

(2)在转化步骤之后，需要对转化后的毕赤酵母进行筛选，以获得能够分泌表达精氨酸脱亚胺酶的重组菌株。这通常通过平板筛选和液体培养来实现。首先，将转化后的酵母细胞涂布在含有选择标记的培养基上，如含有抗生素的培养基，以筛选出含有重组质粒的酵母细胞。接着，对筛选出的阳性克隆进行液体培养，通过检测培养基中的精氨酸脱亚胺酶活性来确认重组菌株的表达情况。此外，还可以通过Westernblotting等方法检测重组菌株中精氨酸脱亚胺酶的蛋白质表达。

(3)为了优化精氨酸脱亚胺酶的表达量和活性，需要对发酵条件进行系统优化。这包括调整培养基成分、发酵温度、pH值、溶氧量等。首先，通过预实验确定培养基的基本配方，包括碳源、氮源、维生素和微量元素等。然后，在单因素实验的基础上，通过响应面分析法（RSM）或正交实验设计（OED）等方法，对发酵条件进行多因素优化。在发酵过程中，定期取样检测精氨酸脱亚胺酶的活性，并通过统计分析确定最佳发酵条件。最终，通过优化后的发酵条件，可以获得高产量和高活性的精氨酸脱亚胺酶。

四、专利申请及保护范围

(1)本发明的专利申请已提交至中国国家知识产权局，并于申请日获得受理。根据专利审查结果，本发明涉及一种利用毕赤酵母分泌表达精氨酸脱亚胺酶的方法，该方法的创新点在于通过基因工程改造，成功提高了精氨酸脱亚胺酶在毕赤酵母中的表达量和活性。实验结果显示，与未改造的毕赤酵母