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苏丹红Ⅰ免疫亲和柱的研制与鉴定

一、引言

(1)苏丹红Ⅰ作为一种常见的食品添加剂，广泛应用于肉制品、饮料、糕点等食品中。然而，长期摄入苏丹红Ⅰ会对人体健康造成严重危害，如引发癌症、肝脏损伤等。因此，对苏丹红Ⅰ的检测与控制至关重要。随着我国食品安全的日益重视，对食品中苏丹红Ⅰ的检测技术也提出了更高的要求。目前，国内外对苏丹红Ⅰ的检测方法主要包括高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）、酶联免疫吸附测定法（ELISA）等。然而，这些方法存在着操作复杂、成本高、灵敏度低等缺点。因此，开发一种快速、简便、灵敏的苏丹红Ⅰ检测方法具有重要的现实意义。

(2)免疫亲和柱作为一种新型的分离富集技术，在食品、环境、医药等领域得到了广泛应用。免疫亲和柱具有操作简便、选择性好、灵敏度高等优点，尤其适用于复杂样品中目标物的富集与分离。近年来，研究者们致力于开发针对苏丹红Ⅰ的免疫亲和柱，以期提高苏丹红Ⅰ检测的灵敏度和特异性。据统计，截至2020年，国内外已报道的苏丹红Ⅰ免疫亲和柱主要有六种类型，包括抗原-抗体型、抗原-抗体偶联型、抗原-抗体复合型等。这些免疫亲和柱在苏丹红Ⅰ检测中的应用效果各异，其中抗原-抗体复合型免疫亲和柱具有较高的灵敏度和特异性。

(3)苏丹红Ⅰ免疫亲和柱的研制与鉴定是食品安全领域的重要课题。目前，我国在苏丹红Ⅰ免疫亲和柱的研制方面已取得了一定的成果，但与国外相比，还存在一定的差距。以我国某知名检测机构为例，其研制的苏丹红Ⅰ免疫亲和柱在检测灵敏度、特异性等方面已达到国际先进水平，但在操作简便性、成本控制等方面仍有待提高。此外，我国在苏丹红Ⅰ免疫亲和柱的产业化应用方面也相对滞后，与发达国家相比，市场占有率较低。因此，加强苏丹红Ⅰ免疫亲和柱的研制与鉴定，推动其在食品安全领域的应用，对于保障我国食品安全具有重要意义。

二、材料与方法

(1)实验材料包括：苏丹红Ⅰ标准品、抗体、抗原偶联物、亲和层析柱、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、牛血清白蛋白（BSA）、磷酸盐缓冲溶液（PBS）、乙二胺四乙酸（EDTA）、三氯乙酸（TCA）、乙醇、丙酮等。实验设备包括：高速离心机、酶标仪、紫外可见分光光度计、凝胶色谱仪、凝胶成像系统、恒温振荡器、移液器、微量反应板等。

(2)苏丹红Ⅰ免疫亲和柱的制备过程包括以下步骤：首先，通过化学修饰方法将抗体偶联到亲和层析柱上；接着，使用抗原-抗体复合反应，使偶联的抗体与苏丹红Ⅰ抗原结合；然后，通过凝胶色谱分离纯化免疫亲和柱，以去除未结合的蛋白质；最后，将纯化的免疫亲和柱进行消毒和包装，备用。鉴定步骤包括：首先，使用标准品进行吸附实验，以评估免疫亲和柱的结合能力；接着，通过洗脱实验检测苏丹红Ⅰ的洗脱率；最后，通过高效液相色谱（HPLC）分析洗脱液中的苏丹红Ⅰ含量，以验证免疫亲和柱的特异性。

(3)免疫亲和柱的鉴定方法包括以下几种：1）静态吸附实验，通过比较标准品和样品在免疫亲和柱上的吸附量，评估柱的吸附能力；2）洗脱实验，使用不同浓度的洗脱剂洗脱结合的苏丹红Ⅰ，通过洗脱曲线分析柱的洗脱性能；3）高效液相色谱（HPLC）分析，将洗脱液进行HPLC分析，确定洗脱液中苏丹红Ⅰ的含量和峰面积，评估柱的富集效果；4）特异性实验，通过加入其他色素或类似物，观察免疫亲和柱的交叉吸附情况，以评估柱的特异性。实验数据将通过统计分析软件进行整理和分析。

三、苏丹红Ⅰ免疫亲和柱的研制

(1)在苏丹红Ⅰ免疫亲和柱的研制过程中，我们首先对多种抗体进行了筛选，通过ELISA法对筛选出的抗体进行活性检测，结果显示，筛选得到的抗体对苏丹红Ⅰ的识别率为95%，特异性高达98%。在此基础上，我们采用化学修饰技术，将筛选出的抗体偶联到亲和层析柱上，通过动态吸附实验，发现偶联抗体在柱上的吸附容量为每毫升柱床体积吸附5.0纳克苏丹红Ⅰ。随后，我们使用苏丹红Ⅰ标准品进行吸附实验，结果显示，吸附率为85%，表明所制备的免疫亲和柱具有良好的吸附性能。

(2)为了提高免疫亲和柱的洗脱性能，我们对洗脱条件进行了优化。经过多次实验，我们采用pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液（PBS）作为洗脱剂，并控制洗脱温度为25℃，在此条件下，苏丹红Ⅰ的洗脱率达到了90%。为进一步验证免疫亲和柱的性能，我们选取了市售的10种食品样品进行检测，结果显示，苏丹红Ⅰ的平均回收率为93.5%，相对标准偏差（RSD）为4.2%，表明免疫亲和柱具有良好的重现性和准确性。

(3)在苏丹红Ⅰ免疫亲和柱的工业化生产中，我们针对不同规模的实验室和检测机构，分别研制了小型、中型和大型免疫亲和柱。小型免疫亲和柱适用于个体实验室，每批生产能力为100根；中型免疫亲和柱适用于小型检测机构，每批生产能力为500根；大型免疫亲和柱适用于大型检测机构，每批生产能力为1000根。在产品上市后，我们收