植物基因克隆的工具酶.ppt

1.DNA制剂中可能抑制限制性内切酶活性的物质:蛋白质、酚、氯仿、酒精乙二胺四乙酸（EDTA）十二烷基硫酸钠（SDS）高浓度的盐离子等?DNA样品的纯度第48页,共71页，星期六，2024年，5月2.提高限制性内切酶对低浓度DNA制剂反应效率的方法①增加内切酶的用量，平均每微克底物DNA可高达10单位甚至更多些；②扩大酶催化反应的体积，以使潜在的抑制因素被相应地稀释；③延长酶催化反应的保温时间。第49页,共71页，星期六，2024年，5月?DNA的甲基化1.原核生物的限制-修饰系统的组成成分是：甲基化酶：对自身DNA起修饰作用，从而使限制性内切核酸酶不能识别，保护自身DNA免受降解。限制性内切核酸酶：破坏入侵的外源DNA，防御异源遗传信息进入体内。因此，甲基化作用直接影响限制性内切酶的活性第50页,共71页，星期六，2024年，5月2.从大肠杆菌寄主细胞中分离而来的质粒DNA，通常都混有两种作用于特定核苷酸序列的甲基化酶：dam甲基化酶：催化GATC序列中的腺嘌呤残基甲基化。dcm甲基化酶：催化CCAGG或CCTGG中胞嘧啶残基甲基化。第51页,共71页，星期六，2024年，5月3.基于基因工程从以上知识可知：从正常大肠杆菌菌株中分离出来的质粒DNA，只能被限制性内切核酸酶局部消化，甚至完全不被消化。因此，在基因工程中，为了避免产生上述问题，通常使用失去了甲基化酶的大肠杆菌菌株制备质粒DNA。第52页,共71页，星期六，2024年，5月?酶切反应的温度DNA酶切反应的温度是影响限制性内切核酸酶活性的另一个重要因素。不同的核酸内切酶，具有不同的最适温度，而且彼此之间有很大的变动范围。但，大多数限制性核酸内切酶的标准反应温度都是37℃。第53页,共71页，星期六，2024年，5月酶反应温度（℃）ApaⅠBanⅠBstEⅡMaeⅠMaeⅡMaeⅢSmaⅠTaqⅠ3050604550552565表2-2部分限制性核酸内切酶的最适反应温度第54页,共71页，星期六，2024年，5月?DNA分子结构DNA分子的不同的构型对限制性内切核酸酶的活性也有很大的影响。某些核酸内切酶切割超螺旋的质粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化线性DNA高出许多倍，最高的可达20倍。第55页,共71页，星期六，2024年，5月某些限制性内切核酸酶，对于同一DNA分子上不同位置的识别序列，切割效率明显不同。?DNA分子结构原因可能是侧翼序列的核苷酸成分的差异造的。 一般来说，一种限制性内切核酸酶对其不同识别位点切割速率的差别最多不会超过10倍。第56页,共71页，星期六，2024年，5月?限制性核酸内切酶的反应缓冲液1.缓冲液的主要成分Tris-Cl：使反应混合物的pH恒定在酶活性所要求的最佳数值范围内。对绝大数限制酶来说，最佳pH=7.4。MgCl2：保证酶活性的正常发挥。NaCl或KCl：同上。第57页,共71页，星期六，2024年，5月β-巯基乙醇：防止限制酶的氧化（但也可能有利于潜在污染杂质的稳定性）。牛血清白蛋白（BSA）：对某些限制酶是必需的，它是一种中性蛋白，可防止酶在低浓度蛋白质溶液中变性。?限制性核酸内切酶的反应缓冲液1.缓冲液的主要成分第58页,共71页，星期六，2024年，5月2.缓冲液的分类不同酶对缓冲液的离子强度要求不同，据此缓冲液可分为如下三种：低盐缓冲液（L）：10mmol/LNaCl中盐缓冲液（M）：50mmol/LNaCl高盐缓冲液（H）：100mmol/LNaCl?限制性核酸内切酶的反应缓冲液第59页,共71页，星期六，2024年，5月?限制性核酸内切酶的反应缓冲液3.星号活性（staractv