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dcfh-da荧光探针分子式

一、1.DCFH-DA荧光探针的基本介绍

(1)DCFH-DA，全称为2,7-二氯荧光黄双醋酸酯，是一种常用的荧光探针，广泛应用于细胞内活性氧（ROS）的检测。作为一种水溶性荧光染料，DCFH-DA在细胞内可以被酯酶水解成DCFH，后者在细胞内氧化后形成具有高荧光强度的DCF，从而实现对ROS的定量分析。DCFH-DA探针具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，是细胞生物学和生物化学研究中的重要工具。

(2)在细胞生物学研究中，DCFH-DA探针常用于检测细胞内氧化应激反应。通过荧光显微镜观察，可以直观地观察到细胞内DCF的荧光强度变化，进而评估细胞内ROS的产生水平。此外，DCFH-DA探针还广泛应用于细胞凋亡、细胞活力、神经细胞损伤等研究领域。通过DCFH-DA探针的检测，研究人员可以更加深入地了解细胞内氧化应激与多种生物学过程之间的关系。

(3)DCFH-DA探针的使用方法简单，通常在细胞培养过程中加入DCFH-DA，孵育一段时间后，通过荧光显微镜观察细胞内的荧光强度。此外，DCFH-DA探针还可与其他检测方法结合，如流式细胞术、实时荧光定量PCR等，实现多指标的同时检测。随着荧光探针技术的不断发展，DCFH-DA探针在生命科学领域的应用将更加广泛，为生物学研究提供更多可能性。

二、2.DCFH-DA荧光探针的分子式及结构

(1)DCFH-DA的分子式为C22H15Cl2N3NaO4，分子量为453.25g/mol。该探针的结构由一个荧光黄核心、两个氯原子、一个乙酰基和两个醋酸基团组成。荧光黄核心是一种黄色荧光染料，具有强烈的荧光发射特性。两个氯原子位于荧光黄核心的2和7位置，增强了探针的亲脂性和荧光强度。乙酰基和醋酸基团则负责将DCFH-DA转化为DCF，这是检测ROS的关键步骤。

(2)在DCFH-DA分子中，荧光黄核心的吸收峰位于488nm，发射峰位于525nm。当DCFH-DA被细胞内的酯酶水解后，生成的DCF具有更强的荧光发射特性，其发射峰位于535nm。这种荧光强度的显著增加使得DCFH-DA成为检测ROS的理想探针。例如，在氧化应激实验中，DCFH-DA的荧光强度与细胞内ROS的产生水平呈正相关，通过荧光计可以定量分析ROS的浓度。

(3)DCFH-DA的结构设计使其在细胞内具有很高的渗透性，可以迅速进入细胞内部。此外，DCFH-DA在水中的溶解度较高，便于在细胞培养过程中使用。在实验中，通常将DCFH-DA以10μM的浓度加入细胞培养液中，孵育一段时间后，通过荧光显微镜或流式细胞仪检测细胞内DCF的荧光强度。例如，在一项关于抗氧化剂对ROS清除能力的研究中，研究者通过DCFH-DA探针检测了不同浓度抗氧化剂处理后的细胞内ROS水平，发现随着抗氧化剂浓度的增加，细胞内DCF的荧光强度逐渐减弱。

三、3.DCFH-DA荧光探针的合成方法

(1)DCFH-DA的合成方法有多种，其中一种常用的合成途径是通过2,7-二氯荧光黄（DCF）与醋酸酐反应制备。首先，将DCF与醋酸酐在无水条件下混合，通常在室温或略微加热的条件下反应数小时。在此过程中，醋酸酐中的乙酰基团会取代DCF分子中的氢原子，生成DCFH-DA。该反应的产率通常较高，可以达到70%以上。例如，在一项合成研究中，研究者使用此方法合成了1.5克DCFH-DA，产率为75%。

(2)在合成过程中，为了提高产率和纯度，通常需要在反应体系中加入催化剂和溶剂。常用的催化剂包括对甲苯磺酸和三乙胺等，它们可以促进醋酸酐与DCF的反应。溶剂的选择也很关键，通常使用无水乙醇或乙腈等极性溶剂，这些溶剂有助于提高反应速率和产率。例如，在一项优化合成条件的研究中，研究者发现使用无水乙醇作为溶剂，并在50°C下反应6小时，可以获得最高的产率和纯度。

(3)合成完成后，需要对DCFH-DA进行纯化，以去除未反应的原料、副产物和催化剂。常用的纯化方法包括重结晶、柱层析和薄层层析等。重结晶是其中一种简单且有效的纯化方法，通过将粗产物溶解在适当的溶剂中，然后缓慢冷却，使DCFH-DA结晶析出。这种方法可以获得高纯度的DCFH-DA，纯度可以达到95%以上。例如，在一项研究中，研究者通过重结晶方法，从1.5克粗产物中获得了1.2克纯度为97%的DCFH-DA。此外，DCFH-DA的合成和纯化过程需要在无水、无氧的环境中进行，以防止其水解和氧化。在实验室中，通常使用氮气保护来确保合成过程的顺利进行。

四、4.DCFH-DA荧光探针的应用领域

(1)DCFH-DA荧光探针在细胞生物学领域有着广泛的应用。例如，在研究细胞凋亡时，DCFH-DA可以用来检测细胞内活性氧（ROS）的产生，这是细胞凋亡过程中的关键步骤。通过检测