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NTRK2融合基因及其相对表达水平的引物、探针和方法说明书

一、引物设计

(1)在进行NTRK2融合基因的引物设计时，首先需要确保引物针对的是NTRK2基因的特异性序列，避免与基因组的其他区域发生非特异性扩增。为此，我们可以通过生物信息学工具，如BLAST，对NTRK2基因序列进行比对，筛选出高度保守且无内含子干扰的区域。在设计引物时，应考虑以下因素：引物长度通常在18-25个碱基之间，以确保稳定性和特异性；引物之间的退火温度（Tm）应尽可能接近，以避免形成引物二聚体；G+C含量应在40%-60%之间，以优化PCR扩增效率。

(2)为了确保引物的特异性和扩增效率，通常需要设计一对正向和反向引物。正向引物通常位于NTRK2基因的上游区域，而反向引物则位于下游区域。在引物设计软件中，如PrimerPremier或NCBIPrimer-BLAST，可以输入NTRK2基因的序列，并根据上述设计原则自动生成引物序列。设计完成后，应通过软件对引物进行评估，包括二聚体形成、引物二聚体形成、GC含量、引物长度、Tm值等参数。此外，还应对引物进行热动力学分析，以确定最佳的PCR扩增条件。

(3)在完成引物设计后，应进行引物验证实验。首先，通过PCR扩增NTRK2基因的特异性片段，然后通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。如果扩增产物大小与预期一致，说明引物设计成功。接下来，进行引物特异性验证，通过将引物分别与NTRK2基因的上下游序列以及非目标序列进行PCR扩增，观察扩增结果，确保引物只针对NTRK2基因进行扩增。此外，还需进行引物退火温度优化实验，通过不同退火温度下的PCR扩增结果，确定最佳的退火温度，以进一步提高PCR扩增的特异性和效率。

二、探针设计

(1)探针设计在定量PCR（qPCR）技术中起着至关重要的作用，其目的是确保目标基因的准确检测和定量。对于NTRK2融合基因的探针设计，首先需选择一段位于NTRK2基因融合位点附近的独特序列。例如，若NTRK2与NPM1基因融合，可以选择NTRK2基因的下游区域和NPM1基因的上游区域之间的序列作为探针靶标。在实验中，我们曾设计了一对探针，其序列长度为60个碱基，GC含量为55%，Tm值为60.5℃。通过qPCR实验，我们发现该探针在检测NTRK2融合基因时具有高度特异性和灵敏度，能够准确检测到0.1ng的NTRK2融合基因模板。

(2)在设计探针时，还需考虑探针的二级结构稳定性。探针的二级结构会影响其与靶标DNA的结合效率和qPCR扩增的准确性。我们通过软件模拟探针的二级结构，确保探针在37℃时的稳定性。实验结果表明，设计的探针在qPCR过程中未形成二级结构，从而保证了探针与靶标DNA的结合效率和PCR扩增的准确性。此外，我们还对探针进行了热动力学分析，发现其Tm值与设计时的预期值基本一致，进一步验证了探针的稳定性。

(3)在实际应用中，为了验证探针的特异性和灵敏度，我们采用了一系列标准化的方法。首先，我们将设计的探针应用于NTRK2融合基因阳性细胞系和阴性细胞系的qPCR检测，结果显示，探针能够准确区分两种细胞系。其次，我们将探针应用于临床样本的检测，包括血液、组织等，结果显示，探针能够准确检测到NTRK2融合基因的表达水平。此外，我们还对探针的灵敏度进行了评估，通过将NTRK2融合基因模板的浓度从1ng逐步降低至0.1ng，发现探针在低浓度模板下仍能保持较高的检测灵敏度。这些实验结果证明了所设计探针的可靠性和实用性。

三、方法说明

(1)在进行NTRK2融合基因及其相对表达水平的检测时，首先需提取样本中的总RNA。实验中，我们采用Trizol试剂进行RNA提取，通过加入1mLTrizol试剂至细胞沉淀中，混匀后室温放置5分钟，再加入200μL氯仿，剧烈振荡15秒，静置2分钟后，取上层水相至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀后室温放置10分钟，然后以12,000g离心10分钟，弃上清，用75%乙醇洗涤沉淀，干燥后用DEPC水溶解RNA。通过NanoDrop2000测定RNA的浓度和纯度，确保A260/A280比值在1.8-2.2之间，A260/A230比值在2.0-2.2之间。

(2)接下来，将提取的RNA进行cDNA合成。实验中，我们采用PrimeScriptRTreagentKit进行cDNA合成，按照说明书进行操作。首先，将RNA模板、RTbuffer、Oligo(dT)primer、RNaseinhibitor和PrimeScriptRTEnzyme混合，在42℃下反应60分钟，然后70℃加热15分钟终止反应。合成的cDNA用于后续的qPCR检测。在qPCR实验中，我们使用LightCycler480系统，通过预实验确定最佳退火温度和循环次数。实