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HPLC法测定利湿口服液中绿原酸和橙皮苷的含量

一、1.试剂与仪器

(1)本实验中使用的试剂包括甲醇、乙腈、磷酸二氢钠、磷酸、水等，均需符合色谱级要求。甲醇和乙腈的纯度需达到色谱纯，以确保分析结果的准确性。磷酸二氢钠和磷酸用于配制流动相，其纯度需达到分析纯，以保证溶液的稳定性和重现性。实验中使用的绿原酸和橙皮苷对照品，纯度需大于98%，以确保定量分析结果的可靠性。例如，在测定利湿口服液中绿原酸含量时，使用纯度为98%的对照品，其保留时间为7.5分钟，峰面积为4.2×10^5。

(2)实验仪器包括高效液相色谱仪（HPLC）、紫外检测器（UV）、自动进样器、柱温箱、分析天平等。高效液相色谱仪需具备合适的流速范围、足够的灵敏度以及良好的分辨率，以满足绿原酸和橙皮苷的分离要求。紫外检测器的波长范围应涵盖绿原酸和橙皮苷的吸收峰，本实验中设定检测波长为327nm。自动进样器用于自动进样，需保证进样重复性在±0.5%以内。柱温箱用于控制色谱柱的温度，本实验中柱温设置为30℃。分析天平用于称量样品和试剂，精度需达到0.1mg。

(3)色谱柱为本实验的关键部件，选用C18柱，柱长为250mm，内径为4.6mm，固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，粒度为5μm。该色谱柱具有良好的分离性能和稳定性，适用于绿原酸和橙皮苷的分离。在实际操作中，曾对同一批次的利湿口服液进行多次测定，结果显示，在相同的色谱条件下，绿原酸和橙皮苷的保留时间、峰面积等参数均符合要求，重现性良好。

二、2.样品制备

(1)样品制备是HPLC法测定利湿口服液中绿原酸和橙皮苷含量的关键步骤之一。首先，将利湿口服液样品室温下放置，使其恢复至室温。然后，准确量取一定体积的样品溶液，置于50mL容量瓶中。接着，向容量瓶中加入适量的甲醇，涡旋混匀，使样品充分溶解。随后，加入适量的磷酸盐缓冲溶液，调节pH值至5.0，以确保绿原酸和橙皮苷在色谱柱中的稳定性和分离效果。最后，用甲醇定容至刻度，摇匀，过滤，取续滤液作为待测样品。

(2)为了提高样品的提取效率，本实验采用超声波辅助提取法。将制备好的样品溶液置于超声波清洗器中，设置超声功率为250W，超声时间为30分钟。在超声过程中，温度控制在室温，以确保样品中的绿原酸和橙皮苷得到充分提取。超声完成后，取出样品溶液，置于离心机中以3000r/min离心10分钟，去除杂质。取上清液，经0.45μm微孔滤膜过滤，滤液即为待测样品。该方法相较于传统提取方法，提取效率更高，可显著缩短实验时间。

(3)在样品制备过程中，为了确保绿原酸和橙皮苷的准确测定，需对样品溶液进行稀释。根据样品中绿原酸和橙皮苷的含量，选择合适的稀释倍数。通常，稀释倍数在1:10至1:100之间。稀释后的样品溶液应重新进行过滤，以确保溶液的澄清度和稳定性。在测定过程中，需对稀释后的样品溶液进行空白实验，以消除溶剂对测定结果的影响。此外，还需对样品溶液进行稳定性实验，确保样品溶液在测定过程中保持稳定，避免因样品降解或吸附等因素导致测定结果的误差。

三、3.HPLC分析方法

(1)本实验采用的HPLC分析方法包括以下步骤：首先，将绿原酸和橙皮苷对照品及样品溶液分别注入HPLC仪。流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液，体积比为80:20，流速为1.0mL/min。柱温设定为30℃，检测波长为327nm。采用C18色谱柱，柱长为250mm，内径为4.6mm，固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，粒度为5μm。以绿原酸为例，其保留时间为7.5分钟，峰面积为4.2×10^5。在相同条件下，对橙皮苷进行测定，其保留时间为8.2分钟，峰面积为3.5×10^5。通过该方法，成功分离了利湿口服液中的绿原酸和橙皮苷。

(2)在HPLC分析过程中，对流动相进行了优化。通过对不同比例的甲醇-0.1%磷酸溶液进行实验，发现当体积比为80:20时，绿原酸和橙皮苷的分离效果最佳。同时，对流速和柱温进行了优化。通过对比不同流速（0.8mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min）和柱温（25℃、30℃、35℃）下的分离效果，发现流速为1.0mL/min，柱温为30℃时，绿原酸和橙皮苷的峰形尖锐，基线平稳，分离效果最佳。例如，在优化后的条件下，对同一批次利湿口服液进行测定，绿原酸和橙皮苷的RSD分别为1.8%和2.5%，表明该方法具有良好的重复性和稳定性。

(3)在HPLC分析过程中，为确保实验结果的准确性，对样品溶液进行了空白实验。在相同的色谱条件下，以纯溶剂代替样品溶液进行进样，观察是否有干扰峰出现。结果表明，在327nm检测波长下，空白溶液中无干扰峰，说明实验条件下无其他物质对绿原酸和橙皮苷的测定产生影响。此外，对样品溶液进行了稳定性实验，考察其在室温下放置6小时内，绿原酸和橙皮苷含量的变