普通微生物第十章微生物与基因工程.ppt

B.平末端HpaⅠ 5’-GTTAAC-3’ 3’-CAATTG-5’同裂酶(isoschizomers)同尾酶(isocaudomers)MunⅠEcoRⅠ5’-CAATTG-3’ 5’-GAATTC-3’3’-GTTAAC-5’ 3’-CTTAAG-5’表10-2常用限制酶第73页,共83页，星期六，2024年，5月第41页,共83页，星期六，2024年，5月所用DNA聚合酶：Klenow聚合酶1988年Saiki等从水生栖热菌(Thermusaquaticus)分离到TaqDNA聚合酶火球菌(Pyrococcusfuriosus)分离到PfuDNA聚合酶;从Thermococcuslitoralis分离到VentDNA聚合酶从Thermusthermophilus中分离TthDNA聚合酶校正功能第42页,共83页，星期六，2024年，5月PCR注意事项：引物的设计2.退火温度3.实验操作第43页,共83页，星期六，2024年，5月PCR应用1、基因扩增和制备DNA探针2、临床医学上传染病的检测等3、法医上判定亲缘关系4、定性、定量检测基因表达水平第44页,共83页，星期六，2024年，5月qRT-PCR(quantitativereal-timePCR)第45页,共83页，星期六，2024年，5月四、基因的定位诱变在基因精确限定的位点引入突变1、寡核苷酸指导的定位诱变2、盒式诱变3、PCR定位诱变第46页,共83页，星期六，2024年，5月1.寡核苷酸指导的定位诱变第47页,共83页，星期六，2024年，5月2.盒式诱变(cassettemutagenesis)较大片段的诱变第48页,共83页，星期六，2024年，5月PCR定位诱变3.PCR诱变1）变异部位位于基因的末端引物5‘端限制位点的引入2）变异部位位于基因的中间重组PCR(recombinantPCR)—Higuchi,1988年第49页,共83页，星期六，2024年，5月§3 微生物与克隆载体 克隆载体(cloningvector)：以扩增外源DNA为目的的载体 到目前为止，基因工程中使用的载体基本上均来自微生物第50页,共83页，星期六，2024年，5月克隆载体的基本要求应是一个独立的复制子(replicon)具有多克隆位点具有选择标记安全性第51页,共83页，星期六，2024年，5月载体的种类一、质粒克隆载体二、λ噬菌体克隆载体三、柯斯质粒载体(cosmidvector—黏粒载体)四、M13噬菌体载体五、噬菌质粒载体(phagemid/phasmid)第52页,共83页，星期六，2024年，5月一、质粒克隆载体1.质粒克隆载体的特性：具有独立的复制起点含有多种限制酶的单一识别位点具有较小的相对分子质量1~200kbp外源DNA15kbp具有较高拷贝数具有便于选择的标记易于导入细胞具有安全性第53页,共83页，星期六，2024年，5月2.质粒pBR322的结构特点1977年Bolivar构建环状双链DNA4,361bp外源DNA5kbp左右松弛型质粒，一个复制起点两个抗性基因TetrAmpr多克隆位点（multiplecloningsite;polylinker;24）插入失活(insertionalinactivation):因外源DNA的插入而导致基因失活的现象第54页,共83页，星期六，2024年，5月第55页,共83页，星期六，2024年，5月3.其它质粒载体pUCpGEM系列第56页,共83页，星期六，2024年，5月二、λ噬菌体克隆载体λ噬菌体克隆载体的优点分子遗传学背景十分清楚容量较大（23kbp）具有较高的感染率λ噬菌体克隆载体的构建删除基因组中非必需区除去多余的限制酶切位点第57页,共83页，星期六，2024年，5月λ噬菌体克隆载体的种类插入型载体(insertvector)取代型载体(replacementvector)78%~105%第58页,共83页，星期六，2024年，5月三、柯斯质粒载体(cosmidvector—黏粒载体)由λ噬菌体的粘性末端(cos位点)和质粒构建而成黏粒的优点具有噬菌体的高效感染率，以质粒形式存在具有质粒的复制方