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双脱氧末端终止法
测序的原理主讲：氧气yunFrederick?SangerDNA聚合酶不能从头合成子链01如果dNTP的3’碳上没有羟基02ddNTP——双脱氧核苷酸03双脱氧末端终止法基本原理：ddNTP的结构聚丙烯酰胺凝胶电泳DNA复制01酶：DNA聚合酶02模板：单链DNA03底物：dNTP04引物：需要05引物的作用：提供3’羟基末端DNA复制的特点ddNTP的特点DNA聚合酶不能够区分dNTP和ddNTP。ddNTP参入到寡核苷酸链的3’末端后，DNA链的延长会被迫停止。ddNTP3’位不是-OH，但5’磷酸基团正常。聚丙烯酰胺凝胶电泳特点精度相当高！能分离长度达300-500个碱基，而差别仅一个碱基的同系单链核苷酸序列。01制备单链模板与引物退火02链延伸---终止反应03聚丙烯酰胺凝胶电泳04放射自显影05阅读测序结果操作步骤01双链DNA02单链DNA03单链DNA04加入引物，加热，退火05带引物的模板单链DNA制备单链模板与引物退火链延伸---终止反应带引物的模板单链DNA核素标记的dNTP分成四管双脱氧鸟苷双脱氧腺苷双脱氧胸苷双脱氧胞苷37℃下反应5min后加入EDTA使DNA聚合酶失活含有各种长度DNA分子的溶液EDTA乙二胺四乙酸，一种二价金属离子螯合剂，DNA聚合酶对Mg2+浓度十分敏感。电泳完成，得到凝胶含有各种长度DNA分子的溶液95℃加热变性点样开始电泳冰上冷却聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳完成，得到凝胶01固定凝胶02真空抽干03放入X射线片夹04得到X射线片05与照相机原理相似，利用射线使胶片感光，然后通过显影过程把“像”显示出来。06放射自显影
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