植物基因工程new.ppt

T-DNA区基因的功能研究方法：用遗传学方法在T-DNA区中引入转座子，使特定的基因发生突变，从而在肿瘤细胞中T-DNA的一个或多个转录产物也随之消朱。基因突变后不能转录出它所编码的mRNA，这时可观察到带有突变基因的T-DNA的植物细胞的表型，从而确定这些基因转录产物的功能。用这种方法证明了编码两类转录产物的基因序列：第93页,共114页，星期六，2024年，5月3.Ti质粒作为植物基因工程的载体1、可行性2、存在缺陷（1）转化植物细胞很难形成完整植株。（2）质粒上分布着多个酶切位点，而不是单一切点，酶切后不易成环，给插入目的基因带来困难。（3）Ti质粒只能在农杆菌中复制、繁殖而扩增，可农杆菌对Ti的转化率太低，只有10—9～10—7左右。（1）将细菌转座子Tn7插入胭脂碱合成酶基因（Nos）位置上，该Ti质粒仍能实现T-DNA转移。（2）用Cat与Nos和Ocs基因启动子拼接后，重组进入Ti质粒，Ti质粒感染植物，植物细胞中检测到了Cat基因的酶的存在。第94页,共114页，星期六，2024年，5月3、去除致瘤基因Onc由于影响植株再生的直接原因是T-DNA中的Onc基因的致瘤作用，因此，切除其致瘤基因，使成为无毒的质粒，记为Onc—，这个过程叫“卸甲”、“缴械”或“解除武装”，构建的Onc—载体叫“卸甲载体”。第95页,共114页，星期六，2024年，5月4、共整合质粒（1）首先构建中间载体，如将大肠杆菌pBR322质粒带上一段与Ti质粒T区同源的一个片段，它在大肠杆菌和农杆菌中均能复制；（2）然后将目的基因插入该片段的适当位置，这样使目的基因两端带上了与Ti质粒T-DNA同源的DNA序列；（3）然后再将该质粒通过转化或接合引入含有Ti质粒的农杆菌中。（4）引入的衍生质粒和原细胞中Ti质粒具同源性，因而可产生无性配对重组，通过交换，可将目的基因转到Ti质粒上，使之产生真正的具有外源基因的Ti质粒，称共整合质粒。第96页,共114页，星期六，2024年，5月3、双元载体“双元载体”，也称反式载体，是指由两个分别含T-DNA和Vir相容性Ti质粒构成的双质粒系统。含有为T-DNA转移所必须的Vir区的质粒，另一个则是含有T-DNA区段的寄主范围广泛的DNA转移载体质粒，后一种质粒较小，可在大肠杆菌中复制，因而易操作，可用来插入外源基因。Binaryvectorsystem,characterisedbythesplittingoftheTi-plasmidintotwo(Ti-plasmidandT-DNAvector).ThesizeofthethreeDNApiecesisnotdrawntoscale.第97页,共114页，星期六，2024年，5月第98页,共114页，星期六，2024年，5月第99页,共114页，星期六，2024年，5月第五节植物基因转化方法

第100页,共114页，星期六，2024年，5月农杆菌介导法基因枪法植物转基因技术花粉管通道法其它方法优点：低成本易操作、转基因的低拷贝数低、导入片段的确定性好。缺点：受作物基因型的影响较大优点：低成本易操作、不受基因型影响、不需要经过组织培养可以获得转基因种子。缺点：导入片段的确定性差、转化效率很低。优点：不受作物基因型的限制。缺点：成本高、转基因的拷贝数高、导入片断的确定性差聚乙二醇法、显微注射法、激光介导法、脂质体介导法第101页,共114页，星期六，2024年，5月?①农杆菌介导转化基因：农杆菌的Ti质粒可以作为载体。Ti质粒上有两个区域，一个是TDNA区，这是能够转移并整合进植物受体的区段；另一个是Vir区，它编码实现质粒转移所需的蛋白质。将待转化的外源基因先克隆在大肠杆菌质粒上，然后将此质粒转入不会引起冠瘿的农杆菌(这种菌的Ti质粒已除去了TDNA)，使外源基因通过同源重组整合在Ti质粒上；然后用带有外源基因的这种农杆菌去转化植物细胞，将外源基因转入植物细胞的基因组。

第102页,共114页，星期六，2024年，5月第103页,共114页，星期六，2024年，5月?②直接转入基因：这是将裸露的DNA直接导入植物细胞，然后将这些细胞在体外培养再生出植株。裸露的DNA的转化效率较低，因而要辅之以高效率的组织培养系统。??

???植物细胞有一层很厚的细胞壁，因此需先去除植物细胞壁，使之成为原生质体，然后用来直接转入外源DNA。当然，也可用机械的方法将DNA直接注入植物细胞而毋须去除细胞壁，这类方法有用显微操纵仪把DNA直接注入植物细胞，