原代细胞的培养和建系.ppt

悬浮细胞培养法对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。器官培养可保持器官组织的相对完整性，可用于重点观察细胞间的联系、排列情况和相互影响，以及局部环境的生物调节作用。器官培养是指从供体取得器官或组织块后，不进行组织分离而直接在体外的特定环境条件下培养，器官培养第三节原代和传代细胞的培养和维持01原代细胞的培养与维持03传代细胞的传代培养02原代细胞培养的首次传代04传代细胞的建系和维持原代细胞的培养与维持A原代细胞培养：静置贴壁细胞（包括半贴壁细胞的培养）培养悬浮细胞的培养B01静置贴壁细胞（包括半贴壁细胞）培养要求02细胞要通过充分漂洗，以尽量除去消化液的毒性。03细胞接种时浓度要稍大一些，至少为5×108细胞/L。04培养基可用Eagle（MEM）或DMEM。05小牛血清浓度为10%-20%。06应在37℃、5%CO2的培养箱中培养。在起始的2天中尽量减少振荡，以防止刚贴壁的细胞发生脱落、漂浮。待细胞基本贴壁伸展并逐渐形成网状，应将原代细胞换液。骨髓或外周血中的悬浮细胞经静置培养1周时，应将细胞悬液经低速离心后换液。030102悬浮细胞的培养要求原代培养时要尽量去除红细胞。短期培养，可在含10%小牛血清的RPMI1640培养基中进行。细胞浓度可在5-8×109/L范围内。进行分瓶试验。长期培养时，淋巴细胞中要加入生长因子，白血病细胞中要加入少量的原患者血清，以利细胞生长。0103020405061细胞换液一般每隔3天需半量换液一次。2细胞传代一般待细胞增殖加快、细胞密度较高时才能进行。贴壁细胞长成网状或基本单层时，未达到饱和密度，需采取换液方式来更新营养成分以满足细胞继续生长繁殖的需要。换入等量完全培养基或换成含2%小牛血清的维持液。悬浮细胞细胞培养基中不仅会发生转化而且会发生分裂繁殖，此时培养基中的营养成分并不能维持细胞的营养需求，需进行换液。通常采用半量换液的方法。原代细胞的维持原代细胞培养的首次传代原代培养后，由于悬浮细胞增殖，数量增加甚至达饱和密度，或贴壁细胞相互汇合，使整个瓶底逐渐被细胞覆盖，细胞难以继续生长繁殖，需要进行分瓶培养，这种使原代细胞经分散接种的过程称之为传代。每进行一次分离再培养称为传一代。首次传代时细胞接种数量要多一些。4首次传代培养的pH应偏低些，小牛血清浓度可加大至15%～20%左右。5细胞生长密度不高时，不要急于传代。1原代培养的贴壁细胞需控制消化时间。2吹打已消化的细胞应减少机械损伤。3首次传代应注意以下几点：传代细胞的传代培养传代细胞，可根据不同细胞采取不同的方法进行细胞传代。贴壁生长的细胞用消化法传代，部分贴壁的细胞用直接吹打或用硅胶软刮的刮除法传代。悬浮细胞可采用加入等量新鲜培养基后直接吹打分散进行传代，或用自然沉降法加入新培养基后再吹打分散进行传代。第四章

原代细胞的培养和建系凡是来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。01凡是经传代方式进行再次培养的细胞称为传代细胞。02若能稳定生长传至10-20代以上的细胞可确立为细胞系。03单细胞经克隆、纯化并大量扩增所形成的特性稳定的细胞群体称为细胞株或克隆细胞。04人和动物细胞的取材是原代细胞培养成功的首要条件，直接影响细胞的体外培养。2017取材要注意新鲜和保鲜012018应严格无菌022019防止机械损伤032020去除无用组织和避免干燥042021注意组织类型、分化程度、年龄等052022作好记录06取材的基本要求各类组织的取材技术01皮肤和粘膜的取材02内脏和实体瘤的取材03血液细胞的取材04骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材05动物组织取材06人胚体组织取材07鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材08皮肤和粘膜的取材01主要取自于手术过程中的皮片，方法似外科取断层皮片手术操作，但面积一般2~4平方厘米。02内脏和实体瘤的取材内脏除消化道外基本是无菌的，但取材时要明确和熟悉所需组织的类型和部位，实体瘤取材时要取肿瘤细胞丰富的区域，要避开破溃、坏死液化部分，以防污染，尽量去除混杂的结缔组织。STEP2STEP1血液细胞的取材血细胞、淋巴细胞的取材，一般多抽取静脉外周血，或从淋巴组织中（如脾、扁桃体、胸腺、淋巴结等）分离细胞，取材时应注意抗凝。骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材1严格无菌，注