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大米中黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A的测定

一、1.样品前处理

(1)样品前处理是毒素测定的关键步骤之一，它直接影响着后续检测结果的准确性和可靠性。对于大米样品，首先需进行取样，确保样品的代表性。根据国家标准，通常从同一批大米中随机抽取多个点进行取样，每个点的样品量约为200克。取样后，将样品进行混合均匀，以确保样品的均一性。在实验室中，通常采用四分法进行样品的初步混合，即取样品的1/4部分，重复此过程，直至获得所需的混合样品。

(2)混合均匀后的样品需要进一步处理，以去除杂质和干扰物质。首先，将样品在60℃的条件下烘干，以去除样品中的水分。烘干过程中，需注意控制温度，避免样品发生炭化。烘干后，将样品研磨成粉末，并通过筛孔大小为0.45毫米的筛子进行筛选，以获得均匀的粉末样品。对于含有较多杂质的样品，可能需要重复研磨和筛选过程，直至达到检测要求。

(3)在进行毒素提取前，需对样品进行预处理，以增加毒素的提取效率。常用的预处理方法包括酸水解和碱水解。以酸水解为例，将筛选后的样品粉末加入一定量的酸性溶液（如盐酸），在一定的温度和压力下进行水解。水解过程中，需控制反应时间和温度，以确保毒素的充分释放。水解完成后，对溶液进行离心分离，去除固体杂质。随后，对上清液进行净化处理，以去除色素、蛋白质等干扰物质。净化方法通常包括固相萃取、液-液萃取等。净化后的样品即可进行毒素的测定。

二、2.黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A的提取与净化

(1)黄曲霉毒素B1（AFB1）和赭曲霉毒素A（OTA）的提取与净化是确保检测准确性的关键步骤。提取过程中，通常采用溶剂萃取法，如乙腈-水混合溶剂。根据不同样品特性，萃取溶剂的比例和用量也会有所不同。以大米样品为例，一般使用乙腈-水（80:20，v/v）作为萃取溶剂，加入量为样品质量的10倍。将样品与萃取溶剂混合均匀后，置于超声波振荡器中提取30分钟，以提高提取效率。以玉米样品为例，萃取溶剂为乙腈，加入量为样品质量的20倍，提取时间同样为30分钟。

(2)提取完成后，将混合液通过滤膜进行过滤，去除固体杂质。过滤后的溶液在低温下进行离心分离，通常以3000转/分钟的速度离心10分钟，以分离出油脂和其他不溶性物质。离心后的上清液即为初步提取液。对于初步提取液，还需进行净化处理，以去除色素、蛋白质等干扰物质。常用的净化方法包括固相萃取（SPE）和液-液萃取。以SPE为例，将初步提取液通过C18固相萃取柱，使用甲醇-水（70:30，v/v）作为洗脱剂，以去除色素和蛋白质。洗脱后的溶液再次通过滤膜过滤，去除残留的杂质。

(3)净化后的溶液即可进行毒素的测定。以AFB1和OTA为例，可采用高效液相色谱法（HPLC）进行测定。在HPLC分析前，需对样品进行衍生化处理，以提高检测灵敏度。衍生化过程中，通常采用三氟乙酸（TFA）和硫酸作为衍生化试剂。将衍生化后的样品注入HPLC仪，通过C18色谱柱分离，以乙腈-水（80:20，v/v）为流动相，流速为1.0毫升/分钟。检测波长设定为225纳米。以AFB1为例，其检测限可达0.05微克/千克，回收率在80%至120%之间。OTA的检测限可达0.1微克/千克，回收率在70%至110%之间。通过HPLC分析，可准确测定样品中AFB1和OTA的含量，为食品安全监管提供依据。

三、3.毒素测定方法

(1)毒素测定方法在食品安全检测中扮演着至关重要的角色。对于黄曲霉毒素B1（AFB1）和赭曲霉毒素A（OTA）的测定，高效液相色谱-荧光检测法（HPLC-FLD）是常用的方法之一。该方法结合了高效液相色谱的分离性能和荧光检测的高灵敏度，能够有效检测低浓度的毒素。在HPLC-FLD中，样品经过衍生化处理，使得毒素分子能够发出荧光，从而在荧光检测器中实现高灵敏度的检测。以AFB1为例，其最低检测限可达0.01微克/千克，而对于OTA，最低检测限为0.05微克/千克。

(2)另一种常用的毒素测定方法是酶联免疫吸附测定法（ELISA）。ELISA是一种快速、简便的检测方法，特别适用于大批量样品的初筛。该方法基于抗原抗体反应原理，利用特异性抗体与毒素结合，通过酶催化反应产生颜色变化来定量毒素。对于AFB1和OTA，ELISA检测的灵敏度通常在0.5至5微克/千克之间。该方法操作简便，检测时间短，适合现场快速检测。

(3)此外，液相色谱-质谱联用技术（LC-MS/MS）在毒素测定中也得到广泛应用。LC-MS/MS结合了液相色谱的高分离能力和质谱的高灵敏度，能够实现多毒素的同时检测和定量。该方法对于复杂样品中痕量毒素的检测具有极高的灵敏度和选择性。例如，AFB1和OTA在LC-MS/MS中的检测限可达0.01至0.02纳克/毫升。LC-MS/MS技术能够提供准确、可靠的检