普通微生物外源基因在细菌中的表达.ppt

第45页,共45页，星期六，2024年，5月**************************************************启动子的种类（2）Trp启动子:Trp启动子的阻遏蛋白必须与色氨酸结合才有活性，因此，缺乏色氨酸时，该启动子启动，色氨酸丰富时，则停止转录。色氨酸操纵子第13页,共45页，星期六，2024年，5月启动子的种类（3）Tac启动子:Tac启动子是一组由Lac和Trp人工构建启动子，受Lac阻遏蛋白的负调节，它的启动能力比Lac和Trp都强。启动子-35区序列-10区序列PlacTTTACATATAATPtrpTTGACATTAACTPtacTTGACATATAATPtac=3Ptrp=11Plac第14页,共45页，星期六，2024年，5月启动子的种类（4）PL、R启动子:cI基因编码λ噬菌体基因组cI基因的温度敏感突变株cI857ts温度30℃42℃产生阻遏蛋白阻遏启动子转录cI857ts蛋白失活启动子转录第15页,共45页，星期六，2024年，5月启动子的种类（5）T7噬菌体启动子:通过加入诱导物或升温，启动T7RNA聚合酶基因转录，合成T7RNA聚合酶，识别T7启动子，从而启动外源基因高效表达。第16页,共45页，星期六，2024年，5月一、外源基因的转录2、转录的调节与控制主要的转录调控方式：（1）诱导物诱导（2）温度诱导（3）RNA聚合酶调节第17页,共45页，星期六，2024年，5月一、外源基因的转录3、转录终止子 一段位于基因或操纵子的3′端，具有终止转录功能的特定DNA序列。-RNA聚合酶停在DNA模板上不再前进，RNA的延伸也停止，完成转录的RNA从RNA聚合酶上释放下来。第18页,共45页，星期六，2024年，5月二、外源基因的翻译1、核糖体结合位点√1974年Shine和Dalgarno首先发现，简称SD序列；√mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列；√位于mRNA起始密码子AUG上游3~10bp左右，富含嘌呤序列。真核生物的mRNA上没有SD序列，原核细胞表达真核基因时，要置于SD序列后。第19页,共45页，星期六，2024年，5月二、外源基因的翻译2、密码子的偏爱性密码子高频出现的密码子称为偏爱密码子，对应于丰富的tRNA密码子，低频出现的密码子为稀有密码子。第20页,共45页，星期六，2024年，5月二、外源基因的翻译3、终止密码子蛋白质翻译过程中终止肽链合成的信使核糖核酸（mRNA）的三联体碱基序列。一般情况下为UAA、UAG和UGA，它们不编码氨基酸。第21页,共45页，星期六，2024年，5月比较启动子和起始密码子、终止子和终止密码子截然不同的概念。启动子和终止子都是一段特殊的DNA序列，属于基因的非编码区，分别位于编码区的上游和下游，负责调控基因的转录；起始密码子和终止密码子都是mRNA上的三联体碱基序列，分别决定翻译的起始和终止。第22页,共45页，星期六，2024年，5月表达载体的要求与主要调控元件利用原核细胞表达真核基因时应注意：基因的编码区必须是连续的；基因必须置于原核细胞启动子、SD序列和终止子之下；产生的mRNA必须相对稳定并能有效进行翻译和蛋白折叠防止蛋白酶的降解。第23页,共45页，星期六，2024年，5月三、外源基因的表达产物1、非融合蛋白表达外源蛋白不与宿主蛋白融合，使其自身单独表达。非融合蛋白表达载体AUG第24页,共45页，星期六，2024年，5月三、外源基因的表达产物防止非融合蛋白降解的措施√采用蛋白酶含量很低的突变株作为宿主菌√利用胞内蛋白酶抑制剂√分泌、包涵体第25页,共45页，星期六，2024年，5月三、外源基因的表达产物2、融合蛋白表达融合蛋白表达载体麦芽糖结合蛋白蛋白酶裂解位点外源蛋白凝血因子Xa外源蛋白第26页,共45页，星期六，2024年，5月三、外源基因的表达产物融合蛋白表达的优点√较易获得高效表达；√在细胞内比较稳定；√许多融合蛋白可用作抗原。融合蛋白中目标蛋白的分离纯化√酶法：加入蛋白酶切位点Ile-Glu-Gly-Arg可被凝血因子Ⅹa识别