乙肝病毒cccDNA检测.ppt

选择性PCR：cccDNA能被扩增“选择性”PCR：并非万无一失PCR产物自身退火（selfannealing）rcDNA被大量扩增，阳性结果不可靠，定量结果也不可靠HepatologyResearch2003;15:234-243（PBMC）WorldJGastroenterol2004;10(1):82-85(血清)Kock等：反应管中rcDNA含量不能超过105copyHepatology1996;23:405-413血清HBVrcDNA超过108copy/ml，进行荧光PCR可能会出现检测结果假阳性“选择性”PCR：并非万无一失与定性法比较增加了一个荧光探针，探针位于扩增片段区（负链缺口下游），与cccDNA的负链互补。01选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA02rcDNA不能被扩增无荧光信号EcoRI5‘+P1P23200(1)5‘3‘15903‘1820P118201590+3200（1）EcoRIP2cccDNA能被扩增检测到荧光信号选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA实时荧光定量PCR的原理实时荧光定量PCR的原理实时荧光定量PCR的原理选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA结果：标准曲线方程YCtcopy相关指数：R2=0.995灵敏度至少可以达到103copy/ml同样存在PCR产物自身退火引起的rcDNA非特异性扩增的问题由于灵敏度较普通PCR高，假阳性率比普通PCR更高01缺陷：01选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA01质粒标准品107copy/ml3.5×108copy/ml携带者血清质粒标准品105copy/ml105~107copy/ml携带者血清选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA解决方案特异性抽提分离cccDNA与其它形式的病毒DNA采用沉淀法或质粒抽提试剂盒抽提法酶切纯化cccDNA采用绿豆核酸酶或ATP依赖的plasmid-safeDNA酶选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR)?侵入者探针法（Invaderassaay）01嵌合引物荧光PCR法02现有的几种cccDNA检测技术简介032.侵入者探针法(Invaderassay)两个体系：两种特殊的探针：invaderprobe和primaryprobe，后者含与待测模板无关的5’侧翼的碱基片段。荧光共振能量转移系统：被核酸内切酶Ⅰ(cleavase,裂解酶)特异地切割5’侧翼碱基片段作为第二个invader，与荧光共振能量转移盒（FRETC）结合，裂解酶切割FRETC上含有荧光基团的短臂，发出荧光信号。特点：一个模板可以重复使用，每“结合—裂解—结合—裂解”一次为一个循环，每循环一次产生一个荧光信号，呈线性信号放大********************************************************乙型肝炎病毒cccDNA

——检测方法与应用价值一、几个相关问题简介什么是HBVcccDNA?即共价闭合环状DNA（covalentlyclosedcircularDNA)。乙肝病毒感染宿主细胞后在细胞内复制并建立感染状态，病毒松弛环状DNA（rcDNA）进入细胞核，利用宿主DNA聚合酶和拓扑酶等“修复”形成的、结构完整的、超螺旋双链DNA分子。乙型肝炎病毒基因组结构示意图乙型肝炎病毒的复制过程我们为什么要关注HBVcccDNA?01?cccDNA存在于细胞核内，成为乙肝病毒的复制“池”02?目前尚没有可以进入细胞核内，并能够清除cccDNA03的药物，这也是现有抗病毒药物治疗效果不佳和治04疗后容易复发的原因之一05?肝脏以外器官组织细胞可能存在cccDNA，成为肝脏06移植术后乙肝复发的来源07?还没有稳定、可靠、敏感的cccDNA检测试剂盒问世为什么没有cccDNA检测试剂盒问世?01研究和开发该检测技术的时间不长02检测技术上的难度较大03前期研究主要集中于细胞模型和动物肝脏04模，不能满足临床检验的需求05现有技术灵敏度不高，检测低限104copy06/ml左右07分研究机构和学者对检测技术的特异性认08识不足，存在缺陷多种同源的乙肝病毒DNA分子并存(cccDNA、