多聚酶链式反应扩增DNA片段》课件新人教版选修.pptVIP

*****************多聚酶链式反应(PCR)的原理1模板DNAPCR反应需要模板DNA作为复制的蓝本，可以是基因组DNA、cDNA或质粒DNA。2引物引物是短的单链DNA片段，与模板DNA的特定序列互补配对，作为DNA聚合酶合成的起始点。3DNA聚合酶DNA聚合酶是一种酶，可以催化新的DNA链的合成，它以引物为起始点，沿着模板DNA链延伸。4dNTPdNTP是脱氧核苷酸三磷酸，是合成新DNA链的原料，包括dATP、dCTP、dGTP和dTTP。PCR反应的三个基本步骤1变性加热使双链DNA解开2退火引物与单链DNA结合3延伸DNA聚合酶合成新链变性:双链DNA解链高温加热到90-95℃，使双链DNA氢键断裂，解开成单链DNA。单链解开的单链DNA可以作为模板参与下一步的反应。退火:引物与模板DNA结合1温度下降反应体系温度降低至引物与模板DNA结合的最佳温度。2引物结合引物与模板DNA上的互补序列特异性结合，形成引物-模板DNA杂交体。3稳定结合引物-模板DNA杂交体在合适的温度和缓冲液环境下保持稳定。延伸:新DNA链合成1DNA聚合酶在引物3端添加核苷酸2模板链提供新链合成的模板3dNTPs作为新链合成的原料DNA聚合酶沿着模板链移动，识别模板链上的碱基，并添加互补的核苷酸，形成新的DNA链。延伸过程需要dNTPs作为原料，并由DNA聚合酶催化完成。DNA聚合酶的作用催化DNA合成DNA聚合酶以单链DNA为模板，以脱氧核苷三磷酸为原料，催化合成与模板链互补的新链。3→5外切酶活性DNA聚合酶具有校对功能，能识别并去除新合成的DNA链中的错误碱基，确保DNA复制的准确性。应用领域一:基因克隆目的基因克隆利用PCR技术可以快速扩增目的基因，为构建基因表达载体提供大量目的基因片段。基因文库构建PCR技术可用于构建基因文库，以便研究特定基因的功能或寻找新的基因。基因改造PCR技术可以用于对基因进行修饰或改造，例如添加标签或引入突变，用于研究基因功能。应用领域二:基因诊断遗传病诊断通过检测基因突变，可以诊断出遗传性疾病，如囊性纤维化、亨廷顿舞蹈症等。感染性疾病诊断检测病原体的基因，可以快速、准确地诊断出感染性疾病，如艾滋病、乙肝等。肿瘤诊断检测肿瘤细胞的基因突变，可以帮助诊断和预后肿瘤，如乳腺癌、肺癌等。应用领域三:犯罪侦查DNA指纹利用PCR技术，可以从犯罪现场的少量生物样本中提取DNA，进行个体识别，为案件侦破提供强有力的证据。亲子鉴定通过比较嫌疑人与受害者的DNA片段，可以判断是否具有亲子关系，为案件侦破提供关键线索。罪犯追踪利用PCR技术可以从犯罪现场的遗留物中提取DNA，并与数据库中的DNA信息进行比对，帮助警方追踪犯罪嫌疑人。应用领域四:古生物学研究古DNA提取PCR技术可以从古老的化石中提取和扩增DNA片段，揭示远古生物的遗传信息。物种进化比较不同年代的古生物DNA序列，可以研究物种的进化关系和演化历程。古环境重建分析古生物DNA中的环境信息，可以推断古代气候、生态系统和生物多样性。应用领域五:基因工程PCR技术在基因工程中广泛应用，例如构建基因表达载体、基因突变、基因敲除和基因沉默等。PCR扩增目标基因后，可将其插入载体中，并导入受体细胞，从而实现基因的表达或功能研究。PCR技术在基因工程领域中发挥着至关重要的作用，推动着生物技术的发展和应用。PCR反应的优势快速PCR技术可以快速复制大量DNA片段，可在数小时内完成反应。灵敏PCR技术具有很高的灵敏度，即使微量的DNA模板也能被放大检测出来。特异性PCR反应可以精确地放大目标DNA片段，避免其他DNA片段的干扰。简便PCR反应操作简单，所需的设备和试剂相对容易获得。PCR反应的局限性污染风险PCR反应对污染非常敏感，即使微量的污染物也会导致假阳性结果。引物设计引物设计不当会导致错误扩增，影响实验结果的准确性。反应条件优化PCR反应条件的优化至关重要，否则可能会影响扩增效率和结果的准确性。引物设计的注意事项1长度引物长度一般为15-30个碱基，太短会导致特异性降低，太长则会影响扩增效率。2GC含量引物GC含量一般为40%-60%，过高或过低都会影响引物的退火温度和特异性。3避免重复序列引物序列中应避免出现重复序列，否则会导致非特异性扩增。4避免形成二级结构引物序列中应避免形成二级结构，否则会影响引物的结合效率。PCR反应条件的优化退火温度优化退火温度可提高引物与模板的结合效率，降低非特