梯度洗脱和多组分含量测定.ppt

2确定色谱条件和供试品制备方法供试品制备方法的确定：评价方法：a1个或多个指标成分的含量；b出峰情况（出峰个数和峰形等）。筛选供试品制备方法时可能用到的实验优化方法：单因素设计正交设计均匀设计响应曲面法确定色谱条件：用混合对照品摸色谱条件R＞1.0即可；fs尽量在0.95~1.05。用样品摸色谱条件满足系统适用性试验要求Part2中药多组分含量测定第33页,共38页，星期六，2024年，5月3方法学验证内容验证的内容Part2中药多组分含量测定3.1标准曲线和线性3.2专属性3.3精密度3.4重复性3.5稳定性3.6回收率3.7耐用性3.8定量限第34页,共38页，星期六，2024年，5月3.1标准曲线和线性分别精密量取一定体积的混标对照品储备液，配成6份浓度不同的混和对照品溶液。按照确定的色谱条件进样,测定各对照品的峰面积。以峰面积（A）为纵坐标，浓度（C,mg·mL-1）为横坐标,绘制标准曲线。确定线性范围及r值。注意：a：先粗测样品各物质含量（如A物质含量为0.05mg·mL-1），将这个含量作为线性中间点(混标中A物质的浓度可配成0.01、0.02、0.04、0.06、0.08和0.10mg·mL-1)；b：混标中各物质间的相对含量要尽量与样品中的相对含量一致；c：Y=ax+b（r≥0.999），当a＞100b时，可用外标一点法(因为这是含量和响应成正比)定量，否则用就用标准曲线法；d：测含量时不应超出此范围，标曲范围不能延长。Part2中药多组分含量测定3方法学验证内容第35页,共38页，星期六，2024年，5月3.2专属性除去含待测成分药材，模拟处方制备中药制剂（阴性样品），按照供试品制备方法制备供试品溶液制成阴性对照溶液，进行HPLC分析，观察被测组分峰的保留时间处是否有其他组分峰的干扰。(附图，横纵坐标一致，相对含量一致，图为两天连着的图，差异不大)Part2中药多组分含量测定3方法学验证内容第36页,共38页，星期六，2024年，5月精密度、重复性和稳定性3.3精密度将一定浓度的混标按照色谱条件,连续进样6次（进样量20μL）,计算每个对照品峰面积的RSD(%)。3.4重复性精密称定同一批号样品6份，按照供试品制备方法制备供试品溶液，进样分析（进样量20μL），测各物质峰面积，用标准曲线法计算含量，最后计算含量的RSD（%）。3.5稳定性取同一份供试品溶液，室温放置，在上述色谱条件下,于0、2、4、6、8、24h分别进样1次，计算各组分峰面积的RSD（%）。看分析周期，处理时间，成分的稳定性，看你分析时间长短。以上三项要求RSD小于2.0%Part2中药多组分含量测定3方法学验证内容第37页,共38页，星期六，2024年，5月3.6回收率试验取已知含量的同一批号的样品（样品取样量为供试品制备项下取样量的一半），共9份，精密称定。然后分别加入相当于取样量80％，100％，120％的对照品溶液，每浓度3份。按照供试品制备方法项下方法操作制备样品。测定各物质含量，计算回收率，公式如下：回收率%＝（实测值－供试品所含被测成分量）/加入对照品量×100%Part2中药多组分含量测定3方法学验证内容第38页,共38页，星期六，2024年，5月*（A：20%乙腈-B：甲醇）0-60min0~100%的B梯度洗脱和多组分含量测定1梯度洗脱的原理及应用2梯度洗脱方法的建立3注意事项主要内容梯度洗脱Part1第2页,共38页，星期六，2024年，5月存在的问题早流出峰的分离度差；迟流出峰的峰宽增加而峰高降低；由于k范围宽，所以分析时间长；强保留组分造成柱污染.等度洗脱Isocraticelution-在洗脱样品的整个过程中，流动相的组成保持不变。1梯度洗脱的原理及应用Part1梯度洗脱第3页,共38页，星期六，2024年，5月梯度洗脱Gradientelution-在分离过程中改变流动相组成.优点改善分离度提高检测性能能够分离复杂样品缩短分析时间降低