时间分辨荧光免疫分析.ppt

四、应用1.肿瘤标志物检测2.传染病检测3.糖尿病检测4.激素检测5.细胞活性检测第30页,共33页，星期六，2024年，5月1.肿瘤标志物AFP测定：双抗体夹心法固相包被抗体加入样品或标准品加入Eu标记抗体加入增强液测定荧光灵敏度：0.17U/ml第31页,共33页，星期六，2024年，5月2.传染病检测梅毒螺旋体抗体检测：双抗原夹心法强阳性血清和正常人血清分别作为阴阳对照阴性对照、阳性对照和样品加入板上，孵育加入铕标记抗原，孵育加入增强液，检测荧光符合中国药品生物制品鉴定所结果第32页,共33页，星期六，2024年，5月3.糖尿病检测C-肽检测：双抗体夹心法抗体包被微孔板加入标准品或样品加入铕标记抗体增强液，检测荧光灵敏度：0.08ng/ml第33页,共33页，星期六，2024年，5月*HCG：（humanchorionicgonadotrophin）人绒毛膜促性腺激素；15年的努力，从仪器到试剂盒****荧光衰减时间比常规荧光试剂长3-6个数量级**NTA：萘甲酰三氟丙酮；PTA：三甲基乙酰三氟丙酮。Eu:铕（有）。Sm:钐(山)。Tb：铽（特）。Dy：镝（笛）。***原子标记：体积小，标记后不会影响标记物的空间立体结构，可实现多个原子标记一个大分子。多标记技术：多种分子的同时检测*BCPDA：*最常用****5-氟水杨酸磷酸酯（5-FSAP）；5-氟水杨酸（5-FSA）**激发均为340nm;Sm：钐。AFP：甲胎蛋白；hCG：人绒毛膜促性腺激素****HBsAg：乙肝表面抗原*CMV：巨细胞病毒，最常见的机会性感染性病毒；IgM：免疫球蛋白。可以消除IgG对IgM测定的干扰**PAPP-A：妊娠相关血清蛋白，产前筛查**C肽：分子量越3K，可以用于判断用胰岛素治疗还是口服药物治疗。时间分辨荧光免疫分析发展历程1979年，可标记抗体的Eu3+-β-二酮体-EDTA1983年，建立时间分辨荧光免疫技术，用于测定HCG和磷酸酯酶A“镧系元素时间分辨荧光分析技术及仪器的配套研究”获2003年度国家科技进步二等奖第2页,共33页，星期六，2024年，5月一、时间分辨荧光免疫分析特点第3页,共33页，星期六，2024年，5月1.荧光衰减时间长镧系元素荧光衰变时间第4页,共33页，星期六，2024年，5月常见荧光物质荧光寿命荧光物质荧光寿命Eu3+714μs非特异性荧光背景1-10ns人血清白蛋白4.1ns人球蛋白、血红蛋白3.0ns细胞色素C3.5nsFITC4.5ns丹磺酰氯14ns苯胺萘磺酸16ns稀土螯合物104-106ns第5页,共33页，星期六，2024年，5月2.Stokes位移大荧光物质激发波长发射波长Stokes位移Eu-(β-NTA)3340nm613nm273nmSm-(β-NTA)3340nm600nm260nmTb-(PTA)3295nm490/543nm195/248nmDy-(PTA)3295nm573nm278nm第6页,共33页，星期六，2024年，5月镧系元素发射峰窄第7页,共33页，星期六，2024年，5月优点灵敏度高（10-18mol/孔）原子标记多标记技术第8页,共33页，星期六，2024年，5月二、时间分辨荧光免疫分析体系非均相时间分辨荧光免疫分析均相时间分辨荧光免疫分析第9页,共33页，星期六，2024年，5月（一）非均相时间分辨荧光免疫分析时间分辨固相免疫分析解离增强荧光免疫分析酶放大免疫分析第10页,共33页，星期六，2024年，5月1.时间分辨固相免疫分析灵敏度一般不高第11页,共33页，星期六，2024年，5月实例加拿大CyberFluor的FIAgen系统Eu3+-BCPDA为标记物第12页,共33页，星期六，2024年，5月2.解离增强分析原理示意图第13页,共33页，星期六，2024年，5月（1）双功能螯合剂EDTA衍生物、DTTA衍生物、DTPA衍生物一端与镧系离子螯合，一端与抗原/抗体连接近中性时，螯合物足够稳定酸性条件下，镧系离子迅速、彻底释放Eu-DTTA应用最广泛第14页,共33页，星期六，2024年，5月（2）增强液增强原理图一般增强百万倍第15页,共33页，星期六，2024年，5月β-NTA：Eu(β-NTA)3(TOPO)2复合物