人胰岛素的制备生物技术制药.ppt

制备基因工程药物的基本过程——人胰岛素的制备一，获取目的基因反转录-聚合酶链反应法(一)从人体细胞内提取胰岛素基因转录的mRNA1,细胞总RNA的提取:取胰岛B细胞，用PBS洗后，加入TRIZOL试将细胞破裂，后用DEPC处理，多次离心后，取RNA白色沉淀，测OD值，电泳。2，从总RNA中分离mRNA：取上述提取的总RNA若干，加入BufferOBB，OligotexSuspension，打匀。70℃水浴（裂解RNA的二级结构），20-30℃条件下，静置（让Oligotex与mRNA结合）。将Oligotex/mRNA复合物的沉淀加到EP管SPIN柱上高速离心，加Buffer将其他RNA洗脱，最后用琼脂糖凝胶电泳纯化mRNA。（二）mRNA转录合成cDNA第一链加入上步获得的mRNA和适当引物于EP管中，加入RNase-freewater，混匀后,70℃反应10分钟，反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5min;稍微离心一下,顺序加入缓冲液、RNA酶抑制剂、反转录酶、dNTP（加入放射性同位素利于检验），?混匀，稍微离心反应物之后,42℃放置2分钟。取出置于冰上。电泳分析，同位素活性测定。cDNA第一链的合成01通过胰岛素的特异引物，用PCR法进行扩增，特异的合成胰岛素的cDNA链,获得目的基因（通过凝胶电泳回收测序后方可使用）。（三）PCR法扩增，特异合成目的cDNA链02前端引物：5’-ggttccggatctggttctggttctctggtcccccgcggtagtcaccaccaccaccaccaccgttttgtgaaccaacacctgtgcggc-3’后端引物：5’-agtgtcgacttagttgcagtagttctccagctggta-3’PCR法的操作步骤：预变性引物退火引物延伸循环25-35次最后延伸二，组建重组质粒采用pBR322作为载体，用双酶切法进行基因重组。一、pBR322简介F.Bolivar和R.L.Rodriguez人工构建载体。其作为载体的优点为：①双抗菌素抗性选择标记插入失活，分两次先后选择：没有获得载体的寄主细胞?在Amp或Tet中都死亡。获得载体的寄主细胞?在Amp或Tet其中之一中死亡。外源基因?BamHIAmp中存活但在Tet中死亡外源基因?PstITet中存活但在Amp中死亡②分子小，克隆能力大载体越小越好。10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。③高拷贝数氯霉素扩增之后，每个细胞可达1000~3000copy④安全失去了转移蛋白基因mob（mobilization),不能通过接合转移。１.双酶切法用两种酶限制性内切核酸酸消化载体DNA和外源DNA片段，使载体和外源目的基因的两端分别形成不同黏性末端，将它们混合，在连接酶的作用下相同的黏性末端可退火连接成重组DNA分子，从而实现DNA的定向连接。２.重组过程pBR322用HindⅢ和BamHⅠ酶切，琼脂糖凝胶电泳分离、回收纯化酶切片段。外源DNA片段同样也用HindⅢ和BamHⅠ酶切并回收纯化酶切片段。双酶切后的载体外源DNA片段混合退火，因为HindⅢ和BamHⅠ的黏性末端不匹配，避免了载体和外源DNA片段的自身连接，外源DNA片段只能定向地连接到载体的HindⅢ和BamHⅠ位点之间。当然也不可避免发生载体的HindⅢ和BamHⅠ的黏性末端之间的两个碱基互补形成开环，转到大肠杆菌中被修复，但这样的重组子占少数，是低效转化。三，构建基因工程菌重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建A链和B链同时表达法重组DNA的转化#2022经典的CaCl2转化方法(二)重组子的筛选和鉴定（载体遗传标记检测）基本操作：先将转化液涂布含有Ap的平板，再将Ap平板上的转化子影印至含有Ap和Tc的平板上，在Ap平板上生长，但在Ap和Tc平板上不长的转化子即为重组子。抗药性筛选法：抗药性筛选法的基本原理：将外源DNA片段插在EcoRI位点：非重组子呈Apr、Tcr重组子呈Apr、Tcr将外源DNA片段插在BamHI位点：非重组子呈Apr、Tcr重组子呈Apr、Tcs再经l％琼脂糖凝胶电泳，限制性图普，PCR检测．DNA测序以及SDS等分析，检测并证实了整个重组体的构建和表达筛选过程四，培养工程菌采用比浊法测定不同时间培养基中菌量，绘制基因工程菌的生长曲线，在摇瓶培养的水平下，采用优