时间分辨荧光免疫分析技术 (2).ppt

时间分辨荧光免疫分析技术标记免疫学分析技术发展历程免疫荧光分析(Coons,1941)放射免疫分析(Berson和Yalow,1960)酶免ELISA(Engvall,1971)金标免疫分析(Faulk和Taylor,1971)化学发光免疫分析(Arakawa，1977)时间分辨荧光免疫分析(Soini和Hemmila，1979)电化学发光免疫分析(Leland,1990)液相芯片(美国Luminex公司,1997)第2页,共23页，星期六，2024年，5月①免疫荧光②放射免疫④化学发光⑥电化学发光⑤时间分辨荧光③酶联免疫第3页,共23页，星期六，2024年，5月标记免疫技术的理论检测灵敏度放射免疫 10-10-10-12mol酶联免疫 10-9-10-10mol化学发光 10-15mol时间分辨荧光10-18mol电化学发光 10-18mol第4页,共23页，星期六，2024年，5月一、时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）

（Time-resolvedfluorescenceimmunoassay）

背景介绍基本原理技术特点反应模式第5页,共23页，星期六，2024年，5月背景介绍1979年，芬兰Wallac公司研发部的Soini和Hemmila首次提出了建立稀土离子标记物的“时间分辨荧光免疫分析”理论1983年，Soini和Kojola首先开发出以镧系元素为示踪物的时间分辨荧光测量仪，建立了新的非放射性微量分析检测技术。同一年，Pettersson等人运用此仪器首次对人绒膜促性腺激素(hCG)进行了时间分辨荧光免疫分析1984年，Hemmila确定了DELFIA(DissociationEnhancedLanthanideFluoroimmunoassay)这种时间分辨免疫分析技术方案,从而使DELFIA成为Wallac的专利技术1988年，加拿大CyberFluor公司的Diamandis创立了一种不同于DELFIA的时间分辨荧光免疫分析，即FIAgen2003年，时间分辨荧光分析技术获国家科技进步二等奖第6页,共23页，星期六，2024年，5月基本原理三价稀土离子包括有铕(Eu)，钐（Sm)，铽(Tb)，镝(Dy)等，它们的荧光光谱具有特异性强﹑Stokes位移大﹑寿命长的特点DELFIA采用异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕(DTTA-Eu)为双功能螯合试剂，其一端螯合Eu3+，另一端可与蛋白质的-NH2连接。在中性或接近中性pH条件下，DTTA与Eu3+具有足够的螯合稳定性，而在增强液（呈酸性）作用下，DTTA-Eu又能将螯合的Eu3+迅速、彻底地释放出来并与增强液中的配体螯合﹑进入胶束的疏水内核，使Eu3+荧光得以成千万倍地放大FIAgen采用的是以Eu3+螯合物配基BCPDA为标记物，通过检测其与过量Eu3+形成的螯合物荧光进行定量。由于BCPDA的可检测性不够理想，FIAgen需要利用生物素-亲合素信号放大来弥补BCPDA检测灵敏度的不足第7页,共23页，星期六，2024年，5月DELFIA标记技术碱性第8页,共23页，星期六，2024年，5月时间:(μs）04008001000340nm激发光第二个循环荧光短寿命荧光613nm长寿命荧光延迟时间测值时间通过时间延迟，将特异性荧光与非特异性荧光分辨开来，使理论本底达到0第9页,共23页，星期六，2024年，5月300400500600荧光强度激发光发射光波长(nm)第10页,共23页，星期六，2024年，5月TbDyEuSm500发射光强度2004000延迟时间(μs)600发射光波长(nm)500发射光强度0延迟时间(μs)第11页,共23页，星期六，2024年，5月TRFIA技术特点极长的荧光衰退时间铕：730000nsStokes位移大铕：激发光340nm，发射光613nm狭窄的发射峰解离-增强技术可使其荧光性提高100万倍第12页,共23页，星期六，2024年，5月固相包被抗体铕标记抗体孵育Eu待测抗原++EuEu+增强液+Eu双抗体夹心法示意图第13页,共23页，星期六，2024年，5月双抗原夹心法示意图Eu++孵育+E