细胞培养技术课件.ppt

在现代医学和生物科学研究中应用广泛

;4.便于使用各种技术：相差、荧光、电镜、组化、同位素标记等方法观察和研究细胞状况。

5.是分子生物学和基因工程学的研究对象，也是其主要的组成部分。

6.易于施用物理、化学生物的实验研究。

7.易于提供大量生物性状相似的实验对象,耗资少比较经济。

8.成为生物制品单克隆抗体生产和基因工程等的材料来源。;缺点：

组织和细胞离体后独立生存在人工的培养环境中，虽然模拟体内环境，仍有很大差异。因而利用培养细胞做实验时，不应视为体内细胞完全相同，把实验结果推测体内，轻易做出与体内等同的结论。

;七.细胞生存环境、条件和代谢

培养细胞生存途径和物质代谢与体内细胞基本相同，随生存环境改变出现一定差异。

（一）环境

培养环境无毒和无菌是保证培养细胞生存的首要条件。保证细胞生存环境无任何污染、代谢物及时清除，是维持细胞生存的基本条件。

;(二)温度：

人哺乳动物：36.5℃±0.5℃;

鸟类：38.5℃;

一般培养细胞对低温的耐受力比高温强温度上升不超过39℃时,细胞代谢强度与温度成正比。

39～40℃1小时,受损伤的细胞可能恢复；

41～42℃1小时,严重损伤,个别细胞恢复；

43℃以上1小时，细胞全部死亡。;温度不低于0℃时,细胞代谢有影响,无伤害作用;

置于25～35℃，细胞能生存，但生长速度减慢；

放在4℃数小时,再放回37℃细胞仍继续生长。

细胞代谢随温度降低而缓慢，温度降至冰点以下时,细胞因胞质结冰受损而死亡。;(三)气体环境和氢离子浓度

气体：氧气和二氧化碳

氧气:参与三羧酸循环产生能量供给细胞生长、增殖和合成各种所需成分。

氧气分压1995～89975Pa,适用于封闭式单层细胞培养;

开放式培养(碟皿或培养瓶松盖培养)细胞置于95％空气加5％二氧化碳混合气体环境中。

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CO2:细胞代谢产物,也是细胞所需成分。其主要作用维持培养基的pH值。大多数细胞的适宜pH7.2~7.4，偏离此范围对细胞将产生有害的影响。

有些细胞存在差异。如羊???细胞培养检测染色体时pH为7.6。;

细胞耐酸比耐碱性大一些,在偏酸性环境中更有利于细胞生长。

为了维持培养液恒定的pH，最常用磷酸缓冲剂方法。

磷酸缓冲剂中NaHco3,可供给CO2但容易逸出，适用：封闭式培养的细胞。（无CO2培养箱）;Hanks平衡液:

含有低浓度的NaHCO3,当打开含有Hank液培养瓶时，CO2迅速逸出而导致酚红指示剂变红，表明培养液pH变碱，细胞在碱性的环境中时间过长可使细胞碱中毒。

;羟乙基哌嗪乙硫磺酸(N`-2-HydroxyethylPiperazine-N`-EthanesulfonicAcid缩写HEPES)

HEPES：

对细胞无毒性也不起缓冲作用，主要作用是：防止pH迅速变动，在开瓶通气培养或活细胞观察时能维持恒定的pH。;（四）细胞生存所需基本物质

与体内基本相同，除碳水化合物、氨基酸、脂类三大类营养物质外，一定量的无机盐、维生素和微量元素等，但需要的量以及代谢方式与体内细胞不尽相同。;糖：六碳糖是主要的能源通过糖酵解形成乳酸和通过柠檬酸形成CO2。

胚胎细胞和一些转化细胞的培养基中常见到乳酸堆积现象。

;糖是合成某些氨基酸的原料；

经过乙酰辅酶A（CoA）合成脂肪；

经过糖解磷酸通路能合成核酸。

各种糖的吸收取决于它们进入细胞的能力,其中葡萄糖最强,半乳糖最低。

;2.氨基酸：

12种氨基酸：精氨酸(Arg)、胱氨酸(Cyst)、异亮氨酸(Zle)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、组氨酸(His)、酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val)是细胞蛋白质合成的原料。

;所有细胞都需要谷胺酰胺，其特殊的作用,可促进各种氨基酸进入细胞膜。

所含的氨是核酸中嘌呤和嘧啶的来源；

是合成3，2和一磷酸腺苷时所需物;

是能源和碳的来源。

如没有谷胺酰胺细胞生长不良而发生细胞死亡。所以要求各种培养液中都含有较大量的谷胺酰胺。;谷胺酰胺在溶液中不稳定，应放置在－20℃冰箱保存，用前加入培养液内。已含有谷胺酰胺